病害问题仍然是对虾养殖业的瓶颈,严重困扰着产业的健康发展。对虾属于无脊椎动物,主要依赖先天免疫体系抵御病原的感染。然而值得注意的是,对虾等甲壳动物中陆续被报道的“免疫致敏”或“训练免疫”现象表明,对虾表现出类似于脊椎动物适应性免疫的特征。目前,虽然部分报道针对该现象背后的机制开展了研究,但是其分子机制仍不清晰。富亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat,LRR）是一保守性较高的氨基酸序列,具有重要的免疫学功能,特别是在无颌类脊椎动物中报道的适应性免疫分子可变淋巴细胞受体（Variable lymphocyte receptor,VLR）,其主要功能域由Leucine-rich repeat（LRR）组成。本研究以凡纳滨对虾为材料,首先基于基因组和转录组数据,鉴定了对虾中含LRR结构域的蛋白（LRR domain-containing proteins,亦称LRR proteins）编码基因,并对其中两条在推导氨基酸序列上与VLR分子特征类似的LRR蛋白编码基因以及一条编码含LRR和Ig结构域（LRRIGs）的基因开展了深入分析和功能研究,阐明了它们在对虾中的免疫学作用,并初步揭示了它们是否与对虾“免疫致敏”现象相关。本论文的主要研究进展如下:1)凡纳滨对虾LRR蛋白编码基因的鉴定。我们基于目前已报道的含LRR结构域的蛋白序列信息在凡纳滨对虾组学数据中对其LRR蛋白家族编码基因进行了筛选鉴定,获得52条编码框完整的LRR蛋白编码基因序列。对筛选的可信度比较高的LRR蛋白编码基因进行基因和推导氨基酸序列结构分析,根据分析结果和注释信息将对虾中LRR蛋白分为12类。除LRR结构域外,许多预测的LRR蛋白还包含其他已报道与生长发育、免疫、代谢等生理过程相关的功能域。进一步对凡纳滨对虾LRR蛋白序列进行分析,发现了部分与无颌类脊椎动物可变淋巴细胞受体蛋白序列特征类似的编码基因（LvVLR-likes）,说明凡纳滨对虾基因组可能编码与无颌类脊椎动物VLR类似的“雏形分子”。2)凡纳滨对虾LvVLRA-like基因的序列分析及免疫学功能研究。序列分析结果显示,凡纳滨对虾LvVLRA-like蛋白与无颌类脊椎动物VLRA有类似的结构组成,除LRR结构域外还包含LRRNT、LRRCT、信号肽和跨膜结构域;进化分析显示,与TLR相比,LvVLRA-like与VLR具有更高的亲缘关系;亚细胞定位实验结果显示该蛋白主要分布在细胞膜上,说明该蛋白可能是一种膜蛋白;组织分布实验结果显示该基因在凡纳滨对虾各免疫组织中呈泛表达模式,且其转录表达水平在副溶血弧菌感染初期的多个免疫相关组织中其转录表达水平显著上调;LvVLRA-like基因被敲降后,副溶血弧菌感染的宿主体内病原数量约是对照组（注射ds EGFP后进行副溶血弧菌感染）对虾中的9倍,且各个时间点宿主累积死亡率也显著高于对照组,说明该基因可能参与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的过程;随后,为了进一步确定该基因发挥作用的调控途径,我们检测了该基因被干扰36h小时后凡纳滨对虾体内抗菌先天免疫信号通路相关基因的表达变化,发现两个NF-κB转录因子编码基因（LvDorsal和LvRelish）以及四条抗菌肽编码基因（LvALF1、LvALF2、LvCrustin1和LvPenaeidin1）都呈显著下调表达趋势,说明凡纳滨对虾LvVLRA-like参与抑制副溶血弧菌增殖是通过调控NF-κB先天免疫信号通路实现的;在病原二次感染后的对虾中,该基因的表达水平与首次感染后没有明显差异,表明该基因可能与对虾“免疫致敏”现象无关。3)凡纳滨对虾LvVLRB-like基因的序列分析及免疫学功能研究。序列分析结果显示,LvVLRB-like蛋白只包含LRR结构域和信号肽,属典型的分泌蛋白;组织表达谱分析结果显示LvVLRB-like基因主要在凡纳滨对虾肝胰腺中表达,在其它组织中水平较低;免疫响应分析结果显示,LvVLRB-like基因在革兰氏阳性菌表皮葡萄球菌感染6h、12h显著上调表达,在革兰氏阴性菌副溶血弧菌感染6h显著上调表达;原核重组表达的LvVLRB-like蛋白对副溶血弧菌有一定的凝集活性,表明该蛋白对病原有一定的识别和结合能力;该基因敲降后,副溶血弧菌感染24h后对虾肝胰腺中病原菌数量明显高于对照组,约为3.84倍,各个时间点的宿主累计死亡率也显著高于对照组;同时,该基因敲降显著降低了LvALF1和LvPenaeidin1两种抗菌肽编码基因的表达水平,但重组LvVLRB-like蛋白对体外培养血细胞的吞噬活性没有显著影响,表明该蛋白在体内与病原结合后可能启动体液免疫信号通路;病原二次感染后的对虾中,该基因的表达水平与首次感染后没有明显差异,表明该基因可能与对虾“免疫致敏”现象无关。4)凡纳滨对虾含LvLRRIG基因的序列分析及免疫学功能研究。序列分析结果表明,凡纳滨对虾LvLRRIG基因编码一种膜受体蛋白,序列包含一个信号肽（SP）,一个LRRNT,12个LRR基序,三个Ig结构域以及一个跨膜结构域（TM）;进化分析结果表明,凡纳滨对虾LvLRRIG蛋白与甲壳动物及昆虫中类似蛋白的亲缘关系较近;副溶血弧菌感染后,LvLRRIG基因在四种被检测免疫相关组织包括肠、鳃、血细胞和Oka中均发生上调表达,特别是在病原感染早期上调表达更为显著;LvLRRIG基因被敲降后,经副溶血弧菌感染的对虾肝胰腺中细菌数量显著增加,约为对照组的10倍;同时,LvLRRIG基因敲降引起了先天免疫信号通路基因包括核转录因子（NF-κB）和四种抗菌肽编码基因（LvRelish、LvALF1、LvALF2、LvPenaeidin1、LvCrustin1）表达量的显著下降,表明凡纳滨对虾LvLRRIG能够通过调控先天免疫信号通路参与宿主的抗病原感染过程;另外,病原二次感染后的对虾中,该基因的表达水平与首次感染后没有明显差异,表明该基因可能与对虾“免疫致敏”现象无关。本论文主要对凡纳滨对虾LRR蛋白家族编码基因进行了筛选鉴定,并在此基础上对其中两种VLR-like基因及一种LRRIG基因进行了深入分析及免疫学功能探究,初步揭示了它们在病原感染过程中的免疫学功能及潜在的作用机制,为无脊椎动物含LRR蛋白的免疫学功能解析提供了新的认识;同时,研究结果也为VLR基因的分子起源提供了参考。