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目的:
1.研究Th17细胞与调节性T细胞(Treg)及相应特异性转录因子RORγt、Foxp3在小鼠哮喘气道炎症中的表达,以及表达量的比值与气道炎症的相关关系,为哮喘发病机制提供理论依据。
2.应用雾化吸入血管活性肠肽(VIP)及其拮抗剂,研究其对哮喘小鼠气道炎症及Th17与Treg细胞的影响,为临床防治哮喘探索新的治疗途径。
3.观察雾化吸入布地奈德混悬液对哮喘小鼠Th17/Treg平衡的影响。
方法:利用卵白蛋白(OVA)致敏和激发制作急性哮喘模型,雄性(体重14-18g)SPF级BALB/c小鼠50只,随机分成5组:对照组(A组,10只)、哮喘组(B组,10只)、布地奈德组(C组,10只)、血管活性肠肽组(D组,10只)、血管活性肠肽+拮抗剂组(E组,10只)。哮喘组及各药物干预组于第1、13天腹腔注射(i.p) OVA/Al(OH)3混悬液致敏,第25天开始予OVA雾化激发,每次30分钟,每天一次,连续8天;对照组致敏和激发均用生理盐水代替。在每次OVA激发前半小时,给予雾化吸入各干预组相应药物。在小鼠最后一次雾化激发后24小时内处死小鼠,并迅速留取相应的血液、支气管肺泡灌洗液(BALF)、肺组织等标本。利用光学显微镜观察肺组织病理变化,对BALF进行细胞总数及分类计数;固相夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清及BALF中IL-17、IL-10水平,免疫组化、实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)法测转录因子RORγt、Foxp3的表达情况等。
结果:
1.肺组织病理变化:哮喘小鼠支气管、肺泡内及血管周围较多炎性细胞浸润,粘膜下水肿、皱折增多,粘液腺增生,气道上皮断裂,肺间质和支气管腔内可见炎性细胞渗出和分泌物,部分有粘液栓形成等。经药物布地奈德及VIP干预后上述表现较哮喘组减轻。
2.细胞总数及分类计数:哮喘组(B组)BALF细胞总数计数[(2.43±0.23)×109]、嗜酸性粒细胞百分比[(10.71±1.06)%]均较对照组(A组)[(0.26±0.12)×109]、[(0.25±0.09)%]显著增高(P<0.01);布地奈德组(C组)分别为[(1.06±0.13)×109]、[(5.82±0.34)%]、VIP组(D组)分别为[(1.19±0.22)×109]、[(5.77±0.28)%]均低于B组,但仍高于A组(P<0.01)。
3.血清、BALF中IL-17浓度结果:哮喘组(B组)血清、BALF中IL-17浓度分别为(68.63±8.41) pg/ml、(48.46±3.33) pg/ml高于对照组(A组)(34.21±7.79) pg/ml、(18.33±3.48)pg/ml(P<0.01);布地奈德组(C组)分别为(49.59±7.20) pg/ml、(27.30±3.68)pg/ml,VIP组(D组)分别为(53.28±5.68) pg/ml、(31.73±4.64) pg/ml与B组比较明显降低(P<0.01),仍高于A组(P<0.01)。E组与B组比较无明显差异。
4.血清、BALF中IL-10浓度结果:哮喘组(B组)血清、BALF中IL-10浓度分别为(41.83±11.05) pg/ml、(59.83±15.09) pg/ml低于对照组(A组)(97.50±18.51)pg/ml、(169.83±27.49) pg/ml(P<0.01);布地奈德组(C组)分别为(65.67±21.42)pg/ml、(93.16±12.91)pg/ml,VIP组(D组)分别为(64.00±19.67) pg/ml、(95.83±25.37)pg/ml与B组比较明显降低(P<0.05或P<0.01),仍低于A组。E组与B组比较无明显差异。
5.肺组织中RORγt、Foxp3 mRNA表达结果:哮喘组(B组)小鼠肺组织RORγt mRNA表达(12.047±0.085)明显高于对照组(A组)(P<0.01),C组(2.877±0.198)、D组(2.229±0.114)呈不同程度降低,仍高于A组(P<0.01或P<0.05)。哮喘组(B)小鼠肺组织Foxp3 mRNA表达(0.217±0.046)低于A组(P<0.01),C组(0.636±0.059)、D组(0.530±0.070)呈不同程度升高,仍低于A组(P<0.01)。E组与B组比较无明显差异。
6.肺组织中RORγt、Foxp3蛋白表达结果:哮喘组(B组)小鼠肺组织RORγt蛋白表达(0.362±0.032)明显高于对照组(A组)(0.259±0.033)(P<0.01),C组(0.312±0.025)、D组(0.304±0.011)呈不同程度降低,仍高于A组(P<0.01)。B组小鼠肺组织Foxp3蛋白表达(0.234±0.042)低于A组(P<0.01),C组(0.292±0.035)、D组(0.289±0.031)呈不同程度升高,仍低于A组(P<0.05或P<0.01)。E组与B组比较无明显差异。
7.相关性分析:肺组织中RORγtmRNA表达量与BALF中细胞总数计数,血清、BALF中IL-17浓度成正相关;与血清、BALF中IL-10浓度成负相关。肺组织中Foxp3 mRNA表达量与血清、BALF中IL-10浓度成正相关;与BALF中细胞总数计数及血清、BALF中IL-17浓度成负相关。肺组织中RORγt/Foxp3 mRNA和蛋白表达量的比值与BALF中细胞总数计数成正相关;与血清、BALF中IL-17浓度成正相关,与血清、BALF中IL-10浓度成负相关。
结论:
1.Th17/Treg免疫失衡参与哮喘小鼠气道炎症损伤过程,同时存在相应的特异转录因子RORγt、Foxp3失衡表达。
2.急性哮喘小鼠经雾化吸入血管活性肠肽能有效影响Th17/Treg免疫失衡,其机制可能与逆转了特异性转录因子RORγt/Foxp3的失衡表达有关。
3.雾化吸入糖皮质激素可以有效的控制哮喘小鼠的气道炎症,其机制之一可能是通过逆转Th17的优势分化,促进Treg的表达,维持哮喘小鼠Th17/Treg免疫平衡状态。