论文部分内容阅读
由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）引起的细菌性溃疡病可导致猕猴桃树叶斑花腐、枝干流脓,甚至毁园,且防治难度大,严重影响我国猕猴桃产业的健康发展。目前,该病害高度依赖化学防治,然而由于农药残留、环境污染、植物病原物抗药性增强等问题显现,以及人们对生活质量、食物品质的要求不断提高,更加安全环保的生物防治受到关注。本研究从发病果园健康植株的根际土中共分离筛选获得6株Psa拮抗菌株,其中菌株ZWP15和CXG2-5拮抗效果最为显著,以此为研究对象,对其分别进行菌株鉴定、防效测定、发酵条件优化、抑菌机理初探和菌剂制备。主要研究结果如下:1.筛选获得6株Psa拮抗菌株,对其中效果良好的2株菌进行了分类鉴定及室内防效评价。于陕西周至、杨凌等地采集发病果园健康植株根际土,采用稀释涂布法分离获得386个单菌落,将其中32个进行划线纯化,通过平板对峙培养筛选出6株对强致病力菌株Psa M228（下称M228）具有拮抗作用的菌株,其中拮抗效果最为显著的2株菌株分别命名为ZWP15（平均抑菌圈直径25 mm）和CXG2-5（平均抑菌圈直径23mm）。经过形态学观察、生理生化测定、分子生物学鉴定,ZWP15为戴尔福特菌（Delftia lacustris）（已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC NO.23331）、CXG2-5为假单胞菌（Pseudomonas benzenivorans）。通过室内离体枝条有伤接种ZWP15、CXG2-5和M228菌悬液(OD600nm=0.1),20 d后测量病斑扩展长度,结果表明ZWP15和CXG2-5的预防效果分别为70.17%和74.22%,治疗效果分别为21.93%和48.89%;通过室内真空渗透叶盘无伤接种ZWP15、CXG2-5和M228菌悬液(OD600nm=0.1),3 d后记录叶盘病斑面积,结果表明ZWP15和CXG2-5的预防效果分别为93.51%和91.85%,治疗效果分别为21.15%和31.90%。2.对生防菌株ZWP15和CXG2-5的发酵条件进行了优化,活性物质和作用机制进行了初步解析。通过单因素试验和正交试验对发酵培养基和发酵条件进行优化,结果表明ZWP15的最优发酵培养基为葡萄糖0.8%,胰蛋白胨1.0%,Na Cl 1.2%,最优发酵条件为温度28℃,转速180 rpm/min,时间96 h,种子液接种量4%;CXG2-5的最优发酵培养基为酵母粉0.6%,胰蛋白胨1.0%,Na Cl 1.0%,最优发酵条件为温度28℃,转速200 rpm/min,时间72 h,种子液接种量4%;通过有机溶剂萃取和提取对活性物质进行了粗提,得到活性粗提物A1和A2,分别稀释100倍后,二者对M228的平均抑菌圈直径仍可达到10.2 mm和26.5 mm,表明其活性物质对M228有强烈的拮抗效果;在此基础上,通过扫描电镜观察粗提物对M228的预防效果,结果表明两种活性粗提物均能有效抑制病原菌M228的侵染和定殖,经活性粗提物处理的猕猴桃离体叶盘内M228数量仅有约60个,显著低于对照处理。透射电镜进行组织细胞学观察,结果表明经活性物质处理后的猕猴桃叶片组织,在接种病原菌3 d后,植物组织与健康叶片相比没有显著差异,而单独接种病原菌M228的叶片组织已经出现了严重变形,细胞出现质壁分离、细胞器降解等现象。该研究表明生防菌株ZWP15和CXG2-5活性物质对有效抑制病原菌M228的侵染和繁殖、保护植物组织具有显著效果,该菌株具有良好的开发价值。3.制备获得了性能稳定的ZWP15可湿性粉剂和CXG2-5微胶囊剂。通过正交试验设计对载体、润湿剂、分散剂、稳定剂、保护剂进行了优化。获得可湿性粉剂最佳配方为成分a 12%、三聚磷酸钠8%、碳酸钙1.5%、糊精1.0%,母粉70%,硅藻土补齐100%。对制得的可湿性粉剂进行质量评价,结果表明其质量悬浮率为70.86%,润湿时间为6.06 s,起泡性小于1 m L,热/冷贮性能稳定,p H平均值为10.47,44μm标准筛通过率为98.08%,以上指标均达到国标要求;以CXG2-5发酵液、海藻酸钠和水氯化钙为原料,通过挤压法制备微胶囊,经单因素试验优化海藻酸钠和无水氯化钙的浓度以及反应时间,得出最佳海藻酸钠浓度为2.2%、无水氯化钙浓度为3.0%、反应时间为3 h,最终制得的微胶囊含水量达到94.8%,自然晾干3 d、6 d、12 d、24 d的微胶囊包埋率保持稳定。4.开展了ZWP15可湿性粉剂和CXG2-5微胶囊剂的田间防治试验,防效良好。选定陕西眉县营头镇烟霞村土壤肥力、栽培管理水平中等的果园做田间防效试验,分别施用ZWP15可湿性粉剂100倍液、CXG2-5微胶囊剂10倍液,以市售20%春雷霉素水分散粒剂3000倍液和枯草芽孢杆菌可湿性粉剂100倍液作对照,空白对照为常规管理;分别于秋季采果后（10月中下旬）、冬季落叶前（11月上旬）、春季开花前（翌年3月上旬）各施药1次;翌年3月中旬进行调查,结果表明ZWP15可湿性粉剂的田间喷施防效为63.34%,主干喷淋防效为75.01%;CXG2-5微胶囊剂的田间喷施防效为60.89%,主干喷淋防效为73.33%。防效均高于枯草芽孢杆菌可湿性粉剂100倍液。综上所述,本研究为猕猴桃溃疡病生物防治提供了重要的材料积累,菌剂研制对田间应用进行了探索,为病害的绿色防控奠定了坚实基础。