近年来结核病在全球呈上升趋势，而在结核病患病率低的地区(如美国、法国、英国等)，非结核分枝杆菌病患病率相对较高。由于AIDS在世界范围内的流行及医源性免疫损害的增长，导致了迅速增高的由非结核分枝杆菌(NTM)所致疾病的发生率。非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria NTM)病的临床症状及X线表现与结核病十分相似，难以区别。很多非结核分枝杆菌对抗结核药物原发性耐药。因此二者之间的鉴别非常重要。随着结核病与NTM所致感染发生率的增加，尤其是因为结核病与NTM所致的感染经常需要不同的治疗措施，临床医生非常需要一种能够快速、准确检测并鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌DNA的方法，用以指导临床的诊断与治疗。 目前临床常用的萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色法，敏感性较低，并且不能区别死菌与活菌。培养法敏感性亦较低，尤其是在已进行抗结核治疗数天后。 我国自二十世纪九十年代初期，即展开了应用PCR技术对分枝杆菌感染的快速诊断的研究。目前，国内已有报告应用经典PCR、套式PCR等分子生物学方法分别检测分枝杆菌或结核分枝杆菌DNA。但在本课题的研究结果发表前，国内尚无同时检测并鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌DNA的报道。 由于以石蜡包埋组织为代表的档案标本能够长期保存，而PCR方法可博士学位论文分枝杆菌DNA的多重聚合酶链反应检测研究以扩增较短的DNA片段，并且在一定程度上可以接受降解的DNA，其高度的敏感性为石蜡包埋组织标本的分子研究提供了条件。 普通的石蜡包埋组织标本，在光学显微镜下很难鉴别结核分枝杆菌复合体感染与非结核分枝杆菌感染。在病理学诊断中，目前尚无结核分枝杆菌病的特异性病理特征的描述，仅在“肉芽肿性炎”这一非特异性诊断中有简单的描述:在光学显微镜下观察组织切片，非结核分枝杆菌比结核分枝杆菌长(约20林m)且粗，呈较粗的珠状，且较弯曲。但是仅根据这一病理组织学特征，二者尚难以鉴别，确诊仍需要依据培养及生化试验的结果。 本课题拟应用多重聚合酶链反应方法检测临床标本，以达到同时检测并鉴别临床标本中的结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌DNA的目的，为临床医生提供病原学的诊断依据。同时，本课题拟应用多重PcR方法对石蜡包埋组织标本进行检测和分析，以达到利用石蜡包埋组织进行分枝杆菌感染的回顾性研究并为结核分枝杆菌复合体感染与非结核分枝杆菌感染的病理学诊断提供一种补充的鉴别诊断方法的目的。具体工作分为以下两部分。博士学位论文分枝杆菌DNA的多重聚合酶链反应检测研究第一部分应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别临床标本 中的结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌DNA 目的为了提高聚合酶链反应(PCR)方法检测分枝杆菌DNA的特异性和敏感性、能够同时检测并鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌DNA。方法应用三对具有特异性的寡核普酸引物，进行多重PCR扩增。这三对引物分别对应于分枝杆菌65KDa表面抗原、结核分枝杆菌插入序列IS耐10及人类p珠蛋白基因的部分序列，其扩增产物分别为383bp、123bP和268饰。结果此种多重PcR方法电泳检测的灵敏度为0.6Pg。经多重PcR扩增后进行凝胶电泳，结核分枝杆菌复合体(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BeG)菌株均可见3s3bp、z23bp片段，而非结核分枝杆菌(鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、凛疡分枝杆菌、蟾蛛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、耻垢分枝杆菌)仅见383bp片段(猿猴分枝杆菌与结核分枝杆菌相同)o与上相比较，模拟分枝杆菌感染的临床标本，分别增加了一条268bp片段。实验中用于对照的所有细菌及肺炎支原体DNA，经多重PCR扩增后电泳，均无上述特异性扩增片段出现。对182例临床标本进行培养、涂片和多重PCR检测。72例非结核性标本，三种检测方法均为阴性;110例结核性标本中，三种检测方法阳性率分别为2.7%、13.6%和32.7%。结论此种多重PCR方法可以同时检测并鉴别结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌DNA(猿猴分枝杆菌除外)，具有高度的特异性和敏感性，是结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的早期诊断与鉴别诊断的一种有价值的检测手段。 关键词多重聚合酶链反应结核分枝杆菌非结核分枝杆菌博士学位论文分枝杆菌DNA的多重聚合酶链反应检测研究第二部分应用多重PcR方法检测石蜡包埋组织 标本中的分枝杆菌DNA 目的应用多重PCR方法检测并鉴别石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌复合体与非结核分枝杆菌DNA扩增片段类型，为结核分枝杆菌复合体感染与非结核分枝杆菌感染的病理学诊断提供一种补充的鉴别诊断方法。方法应用三对具有特异性的寡核普酸引物，进行多重PCR扩增。这三对引物分别对应于分枝杆菌65KDa表面抗原、结核分枝杆菌插入序列15石110及人类口-珠蛋白基因的部分序列，其扩增产物分别为383bp、123bp和 268bp。结果此种多重PcR方法检测的灵敏度为0.6Pg。经多重PcR扩增后进行凝胶电泳，结核分枝杆菌复合体(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BcG)均可见383bP、123bp片段，而非结核分枝杆菌(鸟、龟、痹疡、蟾蛛蛛、堪萨斯、胞内、耻垢分枝杆菌)仅见38