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大肠杆菌(Escherichia coli)作为模式生物虽已广泛用于工业生产,但大肠杆菌对无机酸和有机酸的耐受性还有待提高,发酵过程中若产物不能及时分离出去,酸的累积可能会对菌体造成抑制。迄今对大肠杆菌耐酸的研究仍很欠缺,需要用合适的基因工程、代谢工程手段筛选合适的耐酸基因,提高大肠杆菌发酵法产酸的产量。本文对大肠杆菌进行了一系列代谢工程改造,探索了其耐酸机制;及双质粒情况下,提高菌体的生长和生产能力;并基于群体感应原理建立了状态自动切换模型。主要工作如下:1、对已报道的革兰氏阴性菌和阳性菌中与耐酸相关的基因,在丙酸胁迫下在大肠杆菌中进行耐酸能力的研究。筛选得到过表达编码磷酸葡萄异构酶基因的E. coli BL21(pET-pgi)和编码RNA集合酶σ因子基因的E.coli BL21 (pET-rpoS)能够在丙酸浓度为0.4 g/L的酸性平板上生长;提高丙酸浓度至0.5 g/L, E. coli BL21(pET-rpoS)能够存活,发酵结果显示E. coli BL21(pET-rpoS)的菌体浓度在平稳期基本与野生菌保持一致。丙酸对E.coli BL21(pET-rpoS)的最小抑菌浓度为7.8125mg/mL,是野生菌的2倍。该结果证明pgi和rpoS的表达提高了大肠杆菌酸耐受的能力。2、费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应关键基因luxl和luxR,前者诱导信号分子AHL的合成,后者编码的蛋白质LuxR可与AHL结合从而.诱导启动子PluxI开启转录,AHL可分泌到胞外并在胞间担任信号分子,也可进入其他细胞促使启动子Pluxl的转录。构建产乳酸载体pET-Pluxl-ldhA和群体感应载体pUC-luxI-luxR,共转化缺失乳酸脱氢酶的突变菌E. coli BL21 ΔldhA。发酵结果表明,E. coli BL21 ΔldhA的乳酸最高产量比野生菌减少了43.4%。重组菌E. coli BL21 (pET-Plusl-ldhA+pUC-luxI-luxR)的乳酸产量在菌体密度最高时达到最大值1.233g/L,是对照菌的1.72倍。实验结果表明,在不添加诱导剂的情况下,群体感应可实现菌体从生长到生产的自动切换。3、为提高双质粒系统下大肠杆菌的生长,构建了两个载体分别表达:(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC);(2)与NAD+合成相关的关键酶:烟酸转磷酸核糖激酶(pncB)、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(nadD)和NAD+合成酶(nadE)。将这两个载体共转化大肠杆菌,获得重组菌E. coli BL21(pET-pepc+pUC-pncB-nadD-nadE)。摇瓶发酵显示,与野生型大肠杆菌相比,双质粒工程菌的琥珀酸产量提高了4.23倍,达到0.9 g/L富马酸产量提高了5.23倍,达到5.4 mg/L。实验结果表明加强NAD+合成途径增加了还原三羧酸循环的代谢流量,有效促进了菌体生长。