海生红藻多管藻R-藻蓝蛋白分离纯化及结构特性分析

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本实验选用从烟台海滨采集的新鲜海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata Grev)为研究材料,用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液(PBS)浸取藻胆蛋白,提取液经过滤离心后用500 kDa的膜包超滤,超滤后的透过液用50 kDa的膜包进行截留浓缩。藻胆蛋白浓缩液依次经Sephacryl S-300和Sephacryl S-200凝胶过滤,得到在618 nm和650 nm有特征吸收峰的R-PC/AP组分。R-PC/AP组分先经过Q Sepharose Fast Flow离子交换层析,NaCl浓度梯度(50~250mmol·L-1,150~350 mmol·L-1 洗脱,并在洗脱过程中加入7.5~6.5的pH梯度,分别收集R-PC和AP组分。再选用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析分别纯化离子交换得到的R-PC和AP组分,PBS浓度梯度(400-110mmol·L-1)洗脱收集R-PC、AP、R-PC2。建立了同时制备多管藻两种藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的多维层析方法。收集到的R-PC组分在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示单一条带,R-PC2组分含少量藻红蛋白。经非变性等电聚焦测定,R-PC的等电点为5.63,R-PC2的等电点为5.62;R-PC和R-PC2在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析观察到均有含一种α亚基和两种β亚基,分子质量分别为18.3kDa、20.5kDa和21.4kDa,但是β亚基的相对含量不同,不含无色多肽,变性等点聚焦测得R-PC的两个β亚基的等电点分别为5.8和5.74;R-PC2两个β亚基的等电点分别为5.8和5.75。经二维电泳确定R-PC有四个β亚基分别为β21.45.8、β20.55.8、β21.45.74 β20.55.74
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