论文部分内容阅读
天然胰蛋白酶(NT)容易受外界因素的影响,热稳定性不好,自溶严重。前期研究表明动态高压微射流(DHPM)诱导的去折叠胰蛋白酶(DT)热稳定性提高,但去折叠胰蛋白酶的结构处于热力学上的不稳定状态,容易集聚或再折叠而影响其酶学性能。本课题旨在研究琥珀酰亚胺碳酸酯和琥珀酰亚胺琥珀酸酯活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG-SC和mPEG-SS)修饰对天然胰蛋白酶和去折叠胰蛋白酶活性、热稳定性、自溶、动力学参数和构象变化的影响,对比分析了天然胰蛋白酶和去折叠胰蛋白酶的修饰效果。不同分子量的mPEG-SC(1000、2000、5000、10000、20000Da)修饰对天然胰蛋白酶的活性影响不大,但是酶热稳定性提高,酶自溶降低,其中mPEG-SC(5000Da)修饰的天然胰蛋白酶热稳定性最高,自溶最低。在50℃下,mPEG-SC(5000Da)修饰后天然胰蛋白酶的相对活性由未修饰的32.1%提高到79.4%；在40℃下保温120min后,nPEG-SC(5000Da)修饰后天然胰蛋白酶的相对活性由未修饰的42.3%提高到73.9%。构象变化分析表明,紫外吸光值和荧光强度都下降了,并伴有轻微的蓝移,圆二色谱中负椭圆度升高,说明mPEG-SC修饰影响了天然胰蛋白酶的构象,发色基团部分被掩埋,疏水环境部分被屏蔽,酶分子的微环境发生了变化,二级结构的β-折叠含量上升,无规则卷曲含量下降。5000Da的mPEG-SC修饰后天胰蛋白酶的构象变化最明显,如修饰后天然胰蛋白酶的β-折叠含量由51.2%提高到56.7%。通过mPEG-SC(5000Da)修饰DHPM诱导的去折叠胰蛋白酶,结果表明mPEG-SC修饰对去折叠胰蛋白酶的活性影响不大,但去折叠胰蛋白酶热稳定性得到了极大的提高,酶自溶极大降低了。同时,修饰的去折叠胰蛋白酶与底物的亲和度及催化效能明显提高。修饰后去折叠胰蛋白酶的Km值从0.35mM下降到0.15mM,Kcat/Km值从11.83s-1mM-1上升到20.13s-1mM-1。构象分析表明修饰后去折叠胰蛋白酶的紫外吸光值和荧光强度都下降了,荧光吸收峰有明显的蓝移,说明酶分子中的发色基团和疏水环境被部分掩埋,酶分子所处的微环境发生了改变。二级结构的β-折叠含量上升,无规则卷曲含量下降,修饰后去折叠胰蛋白酶的p-折叠含量从49.7%提高到58.4%。对比分析mPEG-SC修饰对天然胰蛋白酶和去折叠胰蛋白酶的影响,表明修饰的去折叠胰蛋白酶的酶学性能得到了更大程度的改善,而其空间构象的变化也更大。另外,结果表明修饰酶的酶学性质变化与构象改变之间有一定的关联性。分析不同浓度的尿素对mPEG-SC(5000Da)修饰的去折叠胰蛋白酶构象变化的影响,表明修饰后去折叠胰蛋白酶明显提高了对尿素变性作用的抗性。随着尿素浓度的升高,酶样的构象逐渐被破坏,天然胰蛋白酶的结构在尿素浓度为6mol/L时受到最大程度的破坏,去折叠胰蛋白酶在4mol/L时就遭受严重破坏,而修饰后去折叠胰蛋白酶在8mol/L时才遭受严重破坏。研究mPEG-SS(5000Da)修饰对天然胰蛋白酶和去折叠胰蛋白酶酶学性质的影响,表明修饰后的酶活变化不大,但是相比于天然胰蛋白酶,修饰后去折叠胰蛋白酶的热稳定性及与底物的亲和度都大幅提高,自溶大幅降低。另外,对比mPEG-SS和mPEG-SC对天然胰蛋白酶或去折叠胰蛋白酶的修饰效果,表明]nPEG-SC的修饰效果更好。