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植物抗病基因(Resistance Gene,R)产物存在保守结构域,如NBS、LRR、STK、TIR、TM和LZ等。根据这些保守序列设计简并引物寻找R基因同源序列(Resistance Gene Analogs,RGA)的方法称为RGA法。现已在多种植物中分离到了许多RGAs。有的是R基因,有的是抗病候选基因。这不仅预示了植物R基因抗病的可能机理,也为R基因的克隆提供了新途径。所获得的RGAs不但可发展为植物R基因的更精确定位的分子标记,而且有可能广泛应用于包括多年生果树在内的作物R基因的克隆策略中。该方法已在苹果、柑桔等遗传背景复杂的多年生果树上得到成功应用。因此,利用该法克隆热带果树RGAs,对分子标记辅助育种具有重大意义,并为克隆热带果树R基因、深入理解三种热带果树中R基因的结构和功能奠定了基础。 本研究是根据已知植物R基因NBS-LRR和STK保守序列分别设计简并引物,利用PCR和RT-PCR技术从香蕉、番木瓜和芒果嫩叶组织中扩增出RGAs,并对其中部分RGAs的碱基序列及其编码的氨基酸序列进行了分析。同时利用3’RACE技术对番木瓜的cPK2进行了扩增。主要结果如下: 1.根据已知植物R基因NBS-LRR和STK保守序列各设计4对简并引物,采用PCR和RT-PCR技术对香蕉、番木瓜和芒果基因组DNA和cDNA进行了扩增,获得了以500bp为主带的电泳图。回收约500bp条带,连接转化和测序。 2.从香蕉cDNA和番木瓜基因组DNA分别获得1个(B-BNS)和2个NBS-LRR类RGAs序列。它们都具有典型的NBS-LRR催化保守结构域,如磷酸结合环(P-loop,Kinase-1a,(G/P)GXGKTT(a/T))、Kinase-2a(K(K/R)XaaaaDDV(W/D)K)、Kinase-3a(GS-RaaaT(T/S)R)和下游的疏水结构域(HD,GLPLAL),与已知部分R基因(水稻Xal、烟草N、番茄12C-2、拟南芥RPM1和RPS2、番茄Prf)产物的NBS保守结构域具有较高的相似性。但是没有从芒果中得到NBS-LRR类RGA带,可能是由于芒果的R基因比较特殊,没有与实验引物相似的R基因序列,可能需要进一步设计另类简并引物来扩增;或者可能是由于芒果的品种问题。 3.从香蕉、番木瓜和芒果基因组DNA分别获得7条、5条和6条STK类RGAs序列,从番木瓜cDNA获得4条STK类RGAs序列。除番木瓜gPK5外,所有RGAs序列都含有STK保守区的DaKXXN和GTaGYXAP(N/E)等亚保守域,与已知部分R