缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-Ischemic Brain Damage，HIBD）是由于脑组织供血不足引起脑代谢变化而导致的脑组织损害。所谓缺氧指血供中的氧含量减少，缺血指脑血流的灌注量减少，缺氧缺血互为因果[1]。新生儿HIBD是指围产期窒息所导致的严重并发症，是导致儿童神经系统伤残的常见原因之一，积极防治HIBD对降低死亡率、减少神经系统后遗症的发生具有重要的临床意义。而复制与人类HIBD发病相近的动物模型是上述研究的一个重要基础，对深入研究HIBD的病理生理过程、发病机制具有重要的现实意义。HIBD的发病机制尚不十分明确，但细胞坏死和凋亡是直接导致神经功能缺失的最终原因，因此，阻止脑细胞的凋亡成为保护神经细胞功能的重要措施。　　 兴奋性氨基酸（Excitatory amino acid，Eaa）主要指谷氨酸（Glutamate，Glu）和天门冬氨酸（Aspartic acid，Asp），是中枢神经系统中兴奋性突触的主要神经递质。大量研究证实谷氨酸不仅具有营养神经、促使神经元生长发育及轴突生长等重要生理作用，同时也是一种神经毒素，在HIBD的脑损伤中发挥着重要作用[2]。Ca2+内流以及自由基积聚是Eaa兴奋毒性的主要机制，主要产生下列病变：（1）使细胞膜、细胞器膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，降解磷脂并使其活性丧失；（2）使细胞膜对Na+、Ca2+以及大分子物质的通透性增加，细胞发生兴奋毒性水肿和兴奋性递质释放；（3）使细胞的生物酶活性丧失或转化为对细胞有害的酶；（4）破坏线粒体呼吸功能，能量生成障碍，溶酶体裂解，大量溶酶体溢出胞质，促使神经元细胞自溶、坏死。但是与细胞凋亡的关系如何？尚未见报道。　　 在细胞凋亡的调控中，Caspase家族（半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶）是一类在细胞凋亡程序中起关键作用的蛋白水解酶家族，它与细胞凋亡的关系是近来研究的一个热点。研究证实Caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。　　 高压氧（hyperbaric oxygenation，HBO）可改善机体对氧的摄取率和利用率，增加血氧含量，提高血氧分压，增强氧的弥散能力，从而改善脑组织的微循环和有氧代谢，保护缺氧缺血性脑组织。而且，有研究显示HBO能抑制执行型Caspase-3的激活[3]，抑制缺氧缺血性脑细胞的凋亡。在此过程中，能导致脑细胞死亡的兴奋性氨基酸是否也参与了脑细胞凋亡的过程，尚不明确。　　 本实验拟以7d龄SD大鼠作为研究对象，制备脑半球HIBD模型，然后予以HBO治疗，动态检测新生鼠HIBD模型在HBO治疗前后、治疗后18 h、24 h、48 h、96 h等不同时间点海马区和皮层区细胞Caspase-3活性蛋白的表达情况及血清中兴奋性氨基酸（Glu、Asp）的含量变化。以探讨HBO对缺氧缺血性脑损伤是否有保护作用？兴奋性氨基酸是否参与了高压氧抑制脑细胞凋亡的过程，为临床应用HBO治疗HIBD提供有力的理论依据。　　 目的：　　 1、动态观察HIBD及HBO治疗后大鼠血清中兴奋性氨基酸水平及脑细胞凋亡的变化及相关性。　　 2、探讨HBO减轻HIBD大鼠脑细胞凋亡的可能机制。　　 方法：　　 1动物模型的建立：按照文献资料[4]建立标准SD大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型，并随机分为三组：假手术组（24只），HIBD模型组（24只），HBO干预组（24只）。　　 1.1假手术组：仅在乙醚麻醉后做颈部正中切口，分离出左侧颈总动脉后不进行结扎即缝合伤口，不进行缺氧处理。　　 1.2 HIBD模型组：7d龄SD新生大鼠，乙醚（0.3 ml/100mg）吸入麻醉，75％酒精消毒皮肤，行颈部正中切口，长0.5-1cm，分离皮肤及皮下组织，游离出左颈总动脉并用4.0号灭菌丝线双道线结扎，缝合伤口。术后将造模型动物置于自制的1L容积缺氧仓内，以氧氮混合气（氧浓度8％）1 L/min持续灌注2h。缺氧仓置于恒温水浴箱中，维持环境温度在37-37.5℃。缺氧后将新生鼠放回母鼠身边分笼常规喂养。　　 1.3 HBO干预组：HIBD模型大鼠于HIBD造模成功后3h即开始HBO治疗，每天一次，每次1h，疗程4天。　　 2、标本取材：假手术组、HIBD模型组和HBO干预组大鼠分别于造模后18 h、24 h、48 h和96 h留取血样1ml，血样常温离心2000 r/min，15 min，取上清100μl置于超滤管中常温离心11000 r/min，10 min，超滤液置于-40℃冰箱保存，以备做高效液相色谱分析（high performance liquidchromatography，HPLC）。迅速将大鼠断头取脑，脑组织置于4％多聚甲醛中固定24小时后，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。行6μm厚连续切片，以备做病理及免疫组化检测。病理形态学以及免疫组化的检测均以大鼠大脑海马及皮层区为主要观察区域。　　 3、兴奋性氨基酸含量的测定：应用柱前衍生-反相高效液相色谱法测定血清中兴奋性氨基酸（Glu、Asp）的含量。　　 4病理及免疫组化检测：脑组织切片贴附于涂有蛋白甘油的载玻片上，用于常规普通HE染色，观察不同时间干预治疗前、后大鼠脑组织（海马区和皮层区）的病理改变。行免疫组化的脑组织切片贴附于经多聚赖氨酸处理的洁净载玻片上，进行Caspase-3免疫组化染色，观察Caspase-3蛋白的表达程度。　　 结果：　　 1、HE染色：假手术组大鼠脑组织可见细胞周围轻微水肿，而细胞组织结构基本正常。HIBD模型组大鼠皮层及海马区神经细胞呈片状变性、坏死和崩解改变，部分神经细胞呈现出典型的凋亡形态学改变。同时间点HBO干预组大鼠的神经细胞坏死及变性程度较HIBD模型组大鼠明显减轻，凋亡细胞的数量亦显著低于HIBD模型组。　　 2、兴奋性氨基酸含量的测定（μmol/L）：HIBD模型组18h、24 h兴奋性氨基酸Glu的含量分别为（144.98±55.83）、（167.81±67.23）明显高于假手术组大鼠（80.66±38.47），P值均小于0.05，至48 h Glu的含量达到高峰，明显高于假手术组（170.15±65.44），P<0.05，而在96 h Glu的含量有所下降，但仍高于假手术组（164.43±65.45），P<0.05； HIBD组各时间点Asp的含量分别为（5.01±6.94）、（18.79±7.62）、（23.17±10.92）、（16.22±7.87），明显高于假手术组（8.31±3.95），P值均小于0.05； HBO干预组大鼠各时间点兴奋性氨基酸含量虽高于假手术组，但是以明显低于HIBD模型组大鼠（P<0.05），且兴奋性氨基酸含量未见明显高峰（表4-5）。　　 3、免疫组化检测：Caspase-3以阳性细胞染色的积分光密度值（OD）来表示抗原表达量。　　 实验各组Caspase-3活性蛋白表达变化：HIBD模型组18 h、24 h、48 h、96 h大鼠患侧海马区Caspase-3活性蛋白的表达分别为（0.1376±0.0310）、（0.2113±0.0411）、（0.1848±0.0314）、（0.1671±0.0325），明显高于假手术组大鼠（0.1089±0.0023），P值均<0.05，至24 h时间点Caspase-3活性蛋白表达达高峰；HIBD模型组大鼠18 h、24 h、48 h、96 h不同时间段患侧皮层区Caspase-3活性蛋白的表达分别为（0.1323±0.038）、（0.2188±0.0367）、（0.2050±0.0381）、（0.1818±0.0350），明显高于假手术组（0.1234±0.0027），P值均<0.05； HBO干预组大鼠海马区和皮层区各相应时间点Caspase-3活性蛋白表达虽高于假手术组，但已明显低于HIBD模型组大鼠（P<0.05），HBO干预组大鼠未出现上述Caspase-3活性蛋白的表达高峰（见图4-图11）。　　 4、HIBD模型组和HBO干预组中兴奋性氨基酸和Caspase-3活性蛋白表达的变化呈正相关。　　 结论：　　 1、HBO可以减轻新生大鼠HIBD模型神经细胞的凋亡。　　 2、不同时程的HBO干预治疗可以明显降低HIBD模型大鼠皮层、海马神经细胞Caspase-3的活性表达。　　 3、不同时程的HBO干预治疗可降低HIBD模型大鼠血清中兴奋性氨基酸的含量。　　 4、兴奋性氨基酸、Caspase-3活性蛋白表达的一致性变化趋势提示：HBO对脑细胞的保护作用可能是通过抑制兴奋性氨基酸的产生，导致一系列的生化改变，进而抑制下游效应分子Caspase-3的活性表达，最终减少脑细胞的凋亡来完成的。