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第一部分MMP16在TCGA数据库和验证队列中预后价值的研究目的:在TCGA数据库和验证队列中探究MMP16表达水平与肝癌(HCC)患者预后间的关系。方法:(1)在TCGA数据库中选择330位条件符合的肝癌患者,运用单因素及多因素Cox回归分析确定MMP16表达量与肝癌患者生存期之间的关系;(2)在总生存期方面,使用X-tile程序将330位肝癌患者确定出MMP16表达量的最佳截至值,以区分出高表达量和低表达量的两组患者,验证两组患者5年总生存率是否具有统计学差异;(3)随访330位HCC患者,卡方检验探究所有死亡患者中MMP16高表达者所占百分比与尚存活的患者中MMP16高表达者所占百分比是否具有统计学差异;(4)用Kaplan-Meier生存曲线探究另外69例验证队列的肝癌患者MMP16的表达量与5年总体生存期及无病生存期的关系.结果:(1)TCGA肝癌患者数据库中筛选330位患者,Cox回归分析确定MMP16的表达水平对患者预后具有预测作用,可作为患者总生存期的预测因子(HR:1.169,95%CI:1.034-1.321,P=0.013)。(2)在330位TCGA肝癌患者数据库中,X-tile程序区分MMP16高表达和低表达的最佳临界值为-2.50。以此最佳临界值为标准将所有患者分成的MMP16高表达和低表达两组患者,前者的5年总生存率明显高于后者(x2=9.259,P=0.002);(3)在330位TCGA肝癌患者数据库中,有107位患者最终死于该疾病,所有死亡患者中MMP16高表达者所占百分比明显高于存活的患者,差异具有统计学意义(x2=9.188,P=0.002);(4)将69例肝癌患者分为MMP16高表达组和低表达组,Kaplan-Meier生存曲线分析显示,MMP16高表达组5年总生存率明显低于MMP16低表达组(30.7%vs.59.2%,x2=5.172,P=0.023),5年无病生存率也明显低于低表达组(43.2%vs.22.1%,x2=4.119,P=0.042)。结论:在TCGA数据库中,MMP16是肝癌患者总生存期的预测因子,在验证队列中,MMP16是单变量和多变量研究中HCC患者生存期的独立预测因子。第二部分MMP16对肝癌细胞系侵袭能力的影响目的:研究MMP16在HCC组织和正常肝组织中的表达,进一步研究MMP16对HCC肿瘤细胞的增殖和侵袭的影响。方法:(1)本实验使用RT-PCR和IHC从mRNA层面和蛋白层面,分别研究在25个成对的癌组织及其邻近的正常组织中MMP16的表达;(2)运用慢病毒将MMP16转染HepG2和HCCLM3细胞,通过RT-PCR和Western-blot测定干扰后MMP16表达的变化;(3)运用CCK-8测定干扰MMP16表达对HCC细胞的生长速率的影响;采用transwell细胞侵袭试验分析MMP16对HCC细胞侵袭能力的影响。结果:(1)RT-PCR和IHC结果显示:HCC组织中MMP16 mRNA表达水平显着高于其配对的邻近正常组织(P<0.001);IHC研究表明,正常肝组织中只有少量MMP16染色,而其在肿瘤组织中的表达很高。这些数据表明MMP16可能在HCC中表现为致癌基因。(2)慢病毒转染HCC细胞后,RT-PCR和Western-blot测定从mRNA和蛋白两个角度验证转染后HCC细胞的MMP16表达量明显低于未转染细胞。(3)CCK-8测定表明干扰MMP16表达不影响HCC细胞的生长速率。transwell分析结果表明,与对照组相比,MMP16干扰组中跨膜侵袭的细胞数量显着减少(P<0.05),即MMP16的表达降低减弱了 HCC细胞的侵袭能力。结论:MMP16在肝癌细胞表达明显增高,干扰MMP16的表达对肿瘤细胞的增殖能力没有明显的影响,但显著减弱肿瘤细胞的侵袭能力。第三部分MMP16对肝细胞癌侵袭机制的研究目的:由于上皮-间质转化(EMT)与癌细胞侵袭能力密切相关,因此本实验检测MMP16在干扰细胞系及其对照细胞系中的EMT特异标记物来探究MMP16对EMT的影响方法:(1)在mRNA层面,运用RT-PCR方法检测HepG2和HCCLM3两种HCC细胞系分别在干扰MMP16后,E-钙粘蛋白,波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达变化;(2)在蛋白表达层面,运用Western-blot方法检测HepG2和HCCLM3两种HCC细胞系分别在干扰MMP16后,E-钙粘蛋白,波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达量。结果:在mRNA和蛋白水平上,干扰MMP16表达均导致上皮细胞特异性蛋白E-钙粘蛋白的表达量增加,而间充质标记物波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达量下降。结论:MMP16可通过上调EMT过程促进HCC细胞的侵袭能力