论文部分内容阅读
第一部分[研究目的]探索一种优化的下呼吸道微生物DNA提取方法。[研究方法](1)入选IIPs患者,共2例,收集所有研究对象的支气管肺泡灌洗液标本。将每个研究对象的BALF标本等分为2份,根据支气管肺泡灌洗液标本处理方式的不同分为：新鲜样本组和冷冻样本组。新鲜样本组标本采集后,立即行微生物DNA提取。冷冻样本组标本经预处理后,保存于-80℃冰箱,择日行微生物DNA提取。(2)入选IIPs患者,共12例,收集所有研究对象的支气管肺泡灌洗液标本和漱口水样本。将所有研究对象按采用的DNA提取方案随机分为kit1组,kit2组和kit3组,其中BALF样本标记为A,漱口水样本标记为B。根据试剂盒说明书提取样本中微生物DNA。(3)采用Ⅲumina宏基因组DNA文库构建改良法构建DNA文库,采用Hiseq2500二代高通量测序平台行宏基因组测序。将下机宏基因组测序原始数据上传至MG-RAST进行物种比对和基因注释。[结果](1)与新鲜BALF样品相比,由冷冻BALF样品提取得到的DNA中人类基因组比率较低[患者1：59.80%(冷冻BALF样品)和68.60%(新鲜BALF样品),患者2：47.91%(冷冻BALF样品)和66.89%(新鲜BALF样品)]；对于来自同一个体的样本,对于同一数据库的比对结果,冷冻样本可比对上的测序片段数多于新鲜样本；来自同一个体的冷冻样品与新鲜样品的丰度排在前50位的门类构成间有微小差异；对于来自同一个体的样本,新鲜BALF样本与冷冻BALF样本的主要菌群结构无显著性统计学差异。(2)采用含有Benzonase的试剂盒(kit1)纯化得到的BALF或漱口水的DNA产物浓度均低于另外两个试剂盒纯化得到的DNA浓度；采用含有Benzonase的试剂盒(kit1)纯化得到的DNA产物中人源化DNA所占比例显著低于kit2和kit3纯化得到的DNA产物；kit1A组的细菌的丰富度比kit2A和kit3A组(丰富度：P=0.009)显著较高。[结论]采用-80℃低温冷冻保藏技术处理BALF标本,可以得到含较高比例微生物DNA的DNA提取物,不会影响细菌群落结构；采用Benzonase预处理BALF标本,可以显著降低DNA产物中宿主DNA的比例,不会影响细菌群落结构。第二部分[研究目的]识别并比较健康肺和ⅡPs患者的下呼吸道菌群结构特点。[研究方法](1)入选38例对照者(对照组：15例吸烟者,23例非吸烟者)和17例ⅡPs患者(病例组),收集所有研究对象的支气管肺泡灌洗液标本。采用QIAamp DNA Microbiome Kit行微生物DNA提取。(2)采用Illumina宏基因组DNA文库构建改良法构建DNA文库,采用Hiseq2500二代高通量测序平台行宏基因组测序。(3)将下机宏基因组测序原始数据上传至MG-RAST进行物种比对和基因注释。[结果]变形菌门为健康肺和IIPs患者下呼吸道主要优势菌门,其次为厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门。在菌属水平上,与对照组相比,病例组柄杆菌属、嗜血杆菌属和拟杆菌属显著较低,无色杆菌属、鲍特菌属和红球菌属显著增高；病例组有6个菌种的相对丰度显著较高(Achromobacter xylosoxidans> Methylobacterium extorquens、 Achromobacter piechaudii、 Bordetella bronchiseptica、 Bordetella parapertussis和Rhodococcus erythropolis),7个菌种水平显著降低(Actinomyces odontolyticus、 Phenylobacterium zucineum、 Neisseria meningitidis、 Caulobacter vibrioides、 Caulobacter sp. K31、 Haemophilus influenza 和 Caulobacter sp.) .丙酸杆菌属相对丰度与血C反应蛋白浓度呈显著负相关,假单胞菌属和伯克氏菌属与血沉及FEV1/FVC%显著负相关,与FVC%、 FEV1%、 VC%和FEV1显著正相关；慢生型大豆根瘤菌属与FEV1/FVC%显著负相关；普雷沃菌属与FEV1/FVC%显著正相关,与FEV1显著负相关。[结论]IIPs患者下呼吸道的主要菌门构成可能与健康人群类似；IIPs患者下呼吸道的菌属和菌种结构失调,且某些菌属与限制性通气功能障碍和炎性因子间显著相关。