第一部分中医药分期治疗对放射性肺损伤患者的临床疗效观察目的以接受放射治疗后符合急性放射性肺炎诊断的胸部肿瘤患者为研究对象,按照前瞻性、随机对照临床研究原则,以呼吸困难评分、中医临床症状评分、影像学检查、生活质量评分作为研究的主要指标,观察中药分期治疗放射性肺损伤的临床疗效及安全性。方法按照多中心、随机、平行对照、单盲研究方法,选择2013年1月至2014年9月期间四川省肿瘤医院门诊及病房、四川省中医院门诊符合RIPI诊断患者64例,采用随机数字法随机分为两组：对照组32例和试验组32例。对照组：西医常规治疗；试验组：西医常规治疗+中药复方(第1-3个月服用中药1号方,第4-6个月服用中药2号方),分别在预计时间评价呼吸困难评分、中医临床症状评分、影像学检查、生活质量评分及治疗后放射性肺损伤分级情况。结果①RTOG分级结果：两组患者治疗6个月后,观察RIP1分级,采用Mann-Whitney U检验进行统计,两组2、3、4级数据比较,P<0.05,具有显著性差异,可以认为试验组在病情分级方面优于对照组。②呼吸困难评分结果：组内比较结果显示,评分整体呈现下降趋势,两组治疗后各时间点与治疗前比较,P<0.05,数据具有显著性差异；两组治疗后6周-3月,P>0.05,治疗后3月-6月,P>0.05,数据无显著性差异,可以认为两组均在治疗前至治疗后6周呼吸困难评分明显下降,治疗后3月两组呼吸困难评分稍升高,但比较无统计学意义,治疗后6月呼吸困难评分再次下降,但比较无统计学意义。组间比较结果显示,治疗前、治疗后1、3、6周组间数据比较,P>0.05,数据无显著性差异；治疗后3、6月组间数据比较,P<0.05,数据具有显著性差异,可以认为,治疗前-治疗后6周,两组在呼吸困难评分的改善方面无明显差异,但治疗后3、6月,试验组在呼吸困难评分改善方面明显优于对照组。③中医临床症状评分结果：组内比较结果示,两组评分整体呈现下降趋势；试验组治疗前-治疗后1周数据比较,P>0.05,数据无显著性差异；对照组治疗前-治疗后1、3周,P>0.05,数据无显著性差异；其余各时间点与治疗前比较,P<0.05,均有显著性差异。组间比较结果显示,除治疗前、治疗后1周外,其余各时间点数据比较,P<0.05,数据具有显著性差异。可以认为治疗1周后的各时间点试验组在中医临床症状评分改善方面明显优于对照组。④影像学评分：组内比较结果显示,评分整体呈现上升趋势,组内各时间点比较,P<0.05,数据有显著性差异。组间比较结果显示,除治疗前外,其余各时间点数据比较,P<0.05,数据具有显著性差异。可以认为试验组在影像学评分改善方面明显优于对照组。⑤KPS评分：采用Mann-Whitney U检验进行统计,Z=-2.640,P<0.05,数据具有显著性差异,可以认为,试验组在生活质量的改善、稳定方面明显优于于对照组。结论①两组RIPI患者呼吸困难在疾病治疗早期均可以明显缓解,中药1号方配合西医常规治疗在呼吸困难缓解率方面稍优于单纯西医常规治疗。可以认为,在急性期西医常规治疗配合中药1号方可以明显增加呼吸困难缓解率。②治疗后3月两组呼吸困难评分在下降后再次轻微升高,考虑与疾病进展相关,其中对照组程度更重,并持续到治疗后6月,试验组在治疗后6月呼吸困难积分下降。可以认为,放射性肺损伤慢性期的治疗上,西医常规治疗有一定局限性,而配合中药2号方可以明显在慢性期继续缓解呼吸困难程度。③RTOG分级：治疗结束后试验组的3、4级RIPI病例数均低于对照组,提示中药1号方不仅能明显缓解早期放射性肺炎所致呼吸困难,也可能存在延缓肺纤维化的作用。④中药分期治疗可以有效缓解RIPI患者的中医临床症状,并且配合中药1号方可以显著改善放射性肺损伤早期肺泡炎的影像学表现,并可能从早期开始减缓RIPI病程的进展,配合中药2号方能进一步延缓肺纤维化的进展程度。⑤中药分期治疗可提高患者生活质量。第二部分中医药分期治疗对小鼠放射性肺损伤的实验研究目的以直线加速器放射造模的C57BL/6雌性小鼠为研究对象,按照随机对照、重复均衡的实验研究原则,以小鼠肺系数、肺组织病理组织学变化、HE染色观察肺泡炎、Masson染色观察肺纤维化、肺组织中转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)及肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表达作为研究的主要指标,观察中药分期治疗对放射性肺损伤模型小鼠病理组织学及分子生物学水平上的影响,进一步明确其治疗放射性肺损伤的疗效并探讨相关机制。方法将45只C57BL/6雌性小鼠随机分为空白对照组15只、盐水治疗组15只和中药治疗组15只。空白对照组：佯装照射+0.9%氯化钠溶液100此灌胃/d；盐水对照组：单次照射16Gy+0.9%氯化钠溶液100-L灌胃/d；中药治疗组：单次照射16Gy+中药100μL分期灌胃/d。其中中药治疗组1-3周予1号方进行灌胃,第4-6周灌胃2号方。每组分别于预计不同时间点(第2、4、6周)随机处死小鼠,采集小鼠肺组织,称重,计算肺系数的变化,取肺组织石蜡切片,光镜下观察小鼠的肺组织病理形态学变化,HE染色观察肺泡炎情况,Masson染色观察肺纤维化情况,肺组织石蜡切片使用免疫组化法染色观察肺组织切片中TGF-β1、TNF-α表达情况,评价中药复方分期治疗RIPI的疗效及相关作用机制。结果①肺系数：组间比较结果示：各组在2、4、6周时比较,P<0.05,各组之间均有明显差异。组内比较结果示：中药治疗组、空白对照组各时间点肺系数比较,P>0.05,均没有显著差异；盐水对照组小鼠肺系数2周-6周比较,P<0.05,有显著性差异,其余各时间点比较均没有显著差异。②肺组织肉眼观察：空白对照组小鼠肺组织表面均光滑,呈粉红色,弹性良好,可完全铺展开；盐水对照组小鼠照射后第2周肺的颜色转变为暗红色,肺组织肿胀,第4周肺的颜色更暗,稍有弹性,硬度增加,第6周肺体积明显缩小,表面呈灰白色,可见凹凸不平小结节,质地较硬,弹性明显降低；中药治疗组第2周肺组织无明显异常,第4周肺组织颜色加深,肺组织肿胀,第6周肺组织出现萎缩情况,程度相比盐水对照组轻。③光镜下病理组织学改变：空白对照组第2、4、6周偶或可见少量炎症细胞渗出,肺泡结构完整,肺泡腔内无明显渗出,各时间点未见成纤维细胞及胶原沉积,无肺纤维化形成。盐水对照组第2周肺泡上皮细胞增生,肺泡间隔增宽,肺泡隔中可见充血、出血及较多巨噬细胞、中性粒细胞浸润,第4周可见肺泡间隔增宽,肺泡间隔及部分肺泡腔内浸润的炎性细胞成份发生变化,少数可见胶原形成,充血、出血无明显变化,第6周肺泡间隔进一步增宽,肺泡间隔被破坏,可见成纤维细胞聚集、胶原沉积,部分肺泡结构消失,部分肺泡腔塌陷,肺纤维化形成。中药治疗组第2周炎性程度较轻,充血及中性粒细胞浸润程度均轻于盐水对照组。第4周充血、出血、渗出程度轻于盐水对照组,并可见少量浆细胞及淋巴细胞。第6周可见中性粒细胞基本消失,主要以淋巴细胞等慢性炎症细胞为主,可见少许成纤维细胞、胶原沉积,其病理变化过程与盐水对照组相似,但其病变范围及胶原沉积程度远较盐水对照组轻,肺泡间隔减小,含气面积增加。病理结果提示模型小鼠肺泡炎主要表现在前4周,至第4周时已经开始出现成纤维细胞聚集,少数可见胶原形成,这种动态的变化与本研究急慢性期的划分几乎吻合。④HE染色观察肺泡炎的情况：空白对照组在第2、4、6周均未观察到肺泡炎情况,而盐水对照组和中药治疗组在第2、4、6周均观察到肺泡炎,并且中药治疗组的肺泡炎主要集中于轻、中度肺泡炎,盐水对照组的肺泡炎分级主要集中于中、重度肺泡炎。在肺泡炎评分方面,组间比较结果示：各组在2、4、6周时比较,P<0.05,各组之间均有明显差异。组内比较结果示：盐水对照组、中药治疗组4周-6周比较,P>0.05,均没有显著差异,其余组内比较均有显著差异。⑤Masson染色观察肺纤维化的情况：空白对照组在第2、4、6周均未观察到肺纤维化情况,盐水对照组和中药治疗组在第2、4、6周均观察到肺纤维化。并且中药治疗组的肺纤维化主要集中于轻度、中度肺纤维化,盐水对照组的肺纤维化分级主要集中于中度、重度肺纤维化,中药治疗组肺纤维化程度较盐水对照组轻。在肺纤维化评分方面,组间比较结果示：各组在2、4、6周时比较,P<0.05,各组之间均有明显差异。组内比较结果示：各组组内比较,P<0.05,均有显著差异。中药治疗组和盐水对照组在肺纤维化评分方面与空白对照组有显著性差异,其中中药对照组在肺纤维化评分方面明显优于盐水对照组。⑥TGF-β1的免疫组化镜下结果显示：空白对照组在各时间点上肺组织支气管粘膜上皮细胞、支气管周围炎性细胞有极少许棕黄色颗粒。盐水对照组TGF-β1在照射后第2周即开始广泛表达于肺组织细支气管粘膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞,亦较多表达于肺间质巨噬细胞及肺泡巨噬细胞、支气管周围炎性细胞等部位。其阳性细胞表达程度在第6周呈高峰。中药治疗组阳性细胞表达的部位与盐水对照组相同。但其阳性细胞表达程度较盐水对照组明显减弱。总体来看,盐水对照组、中药治疗组与空白对照组相比,其阳性细胞表达程度均显著增强。⑦TGF-β1免疫组化的量化结果显示：组间比较结果示：各组在2、4、6周时比较,P<0.05,各组之间均有明显差异。组内比较结果示：各组组内比较,P<0.05,均有显著差异。中药治疗组和盐水对照组在TGF-β1表达方面与空白对照组有显著性差异,其中中药对照组在TGF-β1表达方面明显优于盐水对照组。⑧TNF-a免疫组化的镜下结果显示：空白对照组2、4、6周均在其支气管上皮中TNF-α呈不均一表达,在肺实质中少量肺泡巨噬细胞呈阳性表达,而血管内皮和肺泡上皮细胞均呈阴性。盐水对照组在照射后2周即可见肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞呈阳性表达,肺实质中有大量阳性巨噬细胞聚集在血管外膜周围,照射后4周时整个肺实质布满大量阳性巨噬细胞,TNF-a广泛表达于肺间质巨噬细胞、支气管粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞等部位,其阳性细胞表达程度第4周呈高峰。中药治疗组阳性细胞表达的部位与盐水对照组相同。但其阳性细胞表达程度较盐水对照组明显减弱。总体来看,盐水对照组、中药治疗组与空白对照组相比,其阳性细胞表达程度均显著增强。⑨TNF-α免疫组化量化结果：组间比较结果示：各组在2、4、6周时比较,P<0.05,各组之间均有明显差异。组内比较结果示：空白组组内比较,P>0.05,无显著性差异；盐水对照组和中药治疗组组内比较,P<0.05,均有显著差异并且在第4周为高峰。中药治疗组和盐水对照组在TNF-α表达方面与空白对照组有显著性差异,其中中药对照组在TNF-α表达方面明显优于盐水对照组。结论①中药分期治疗可以减轻RIPI小鼠急性期和慢性期体重的下降程度,并减轻RIPI小鼠肺系数在急性期和慢性期上升的幅度。②无中药干预的盐水对照组小鼠肺泡炎主要表现在前4周,至第4周开始出现成纤维细胞聚集,少数可见胶原形成,至第6周可见大量胶原形成,这种动态的改变大致符合试验前设定1。3周为急性炎症期,4-6周为慢性纤维化期的预想。③中药分期治疗RIPI小鼠可以在病理组织层面上有效减轻急性期肺组织炎性程度(减轻肺组织充血、出血、水肿程度,减少炎性细胞的渗出),同时减轻慢性期肺组织肺纤维化的进展及程度(减少成纤维细胞的聚集,减轻胶原沉积、减轻肺泡结构的破坏和肺泡间隔增宽)。④TGF-β1动态地参加了放射性肺损伤的全过程,在照射初期即开始升高,最初是短暂增高,但约3到4周即又明显增加,在第6周达到高峰。其来源不是炎症细胞,而是Ⅱ型肺泡上皮细胞和成纤维细胞；联系病理变化,在早期,Ⅱ型肺泡上皮细胞明显增生,3到4周后则开始是成纤维细胞增生更明显。⑤中药分期治疗能在急性期及慢性期都明显降低TGF-β1的表达,联系相关病理变化,发现TGF-β1受抑制,不仅纤维化程度明显减轻,炎症反应亦减轻,提示TGF-β1不仅参与了后期纤维化形成,也在早期一定程度上参与了炎性反应。⑥TNF-α在照射后即开始表达,在第4周呈现高峰,同时小鼠病理提示第4周时肺泡炎最重,TNF-α的表达在一定范围内与肺泡炎呈正相关；中医药分期治疗可以在早期明显抑制TNF-α的表达以减轻炎症程度。⑦中药分期治疗RIPI的作用机制可能与下调TGF-p1、TNF-a的表达相关。