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目的:本课题通过Label-Free蛋白质组学技术筛选安子合剂干预后ACA阳性流产小鼠胎盘差异表达蛋白,观察安子合剂对ACA阳性流产小鼠胎盘差异蛋白Tim-3表达、血清Th1/Th2比值以及ACA 阳性流产患者血清差异蛋白Tim-3表达和Th1/Th2比值的影响,从Tim-3调节Th1/Th2平衡的角度,探讨安子合剂的安胎作用机制及临床疗效。方法:1.观察安子合剂对模型小鼠胚胎丢失率及胎盘ACA和TNF-α含量影响:将雌性BALB/c小鼠随机分为5组:空白对照组、模型组、安子合剂低剂量组、安子合剂高剂量组、阿司匹林组,每组10只。除空白对照组外,其余各组小鼠通过腹腔注射β2-糖蛋白Ⅰ(β2GPI)建立ACA 阳性流产模型。从妊娠第1天起,安子合剂低剂量组、安子合剂高剂量组和阿司匹林组灌胃药物,空白对照组和模型组等体积蒸馏水灌胃,每天1次,连续14天。妊娠第8天取外周血,采用酶联免疫法(ELISA)检测血清ACA和TNF-α含量。妊娠第15天处死小鼠,测量胎鼠、胎盘重量,计算胚胎丢失率,ELISA法检测血清、胎盘ACA和TNF-α含量。2.筛选及分析安子合剂对胎盘差异蛋白表达影响:基于Label-Free蛋白质组学技术,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组:空白对照组、模型组、安子合剂组(37.7mg/g·d,相当于成人剂量),每组10只。采用Label-Free蛋白质组学方法筛选各组小鼠胎盘组织中的差异蛋白,进行GO、KEGG功能富集分析和互作网络分析等。应用Western blot验证与RSA发生发展有关的差异蛋白。分析安子合剂干预后ACA 阳性流产小鼠胎盘差异蛋白的表达。3.观察安子合剂通过小鼠胎盘Tim-3对Th1/Th2平衡的影响:将雌性BALB/c小鼠随机分为5组:空白对照组、模型组、安子合剂低剂量组、安子合剂高剂量组、阿司匹林组,每组10只。模型建立及给药按方法1进行。妊娠第15天处死小鼠,取胎盘、外周血。采用Western blot方法检测胎盘Tim-3表达量;流式细胞术检测血清Th1、Th2细胞数,计算Th1/Th2比值;采用ELISA检测血清Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-6、IL-10)含量分析安子合剂干预ACA阳性流产小鼠通过Tim-3影响Th1/Th2平衡的机制。4.观察安子合剂的临床疗效及通过Tim-3影响Th1/Th2平衡的作用机制:收集2018年1月至2019年12月至江苏省中医院就诊的ACA 阳性患者60例,随机分为治疗组和对照组,每组各30例。治疗组予安子合剂口服,125ml/次,每日2次;对照组给予阿司匹林口服,100mg,1次/日。连续给药4周为一个疗程。观察两组患者治疗前后临床症状改善情况、血清ACA抗体的变化以及Tim-3及Th1(IL-2、IFN-γ)、Th2(IL-6、IL-10)细胞含量、Th1/Th2比值变化分析安子合剂通过影响Tim-3降低Th1/Th2比值的疗效机制。结果:1.安子合剂通过降低ACA和TNF-α含量减少小鼠胚胎丢失率:与模型组相比,安子合剂低剂量组、安子合剂高剂量组均能减少血清和胎盘中ACA滴度和TNF-α含量(P<0.05或P<0.01);显著升高胎鼠、胎盘重量(P<0.05),显著降低胚胎丢失率(P<0.05)。2.安子合剂对小鼠胎盘组织差异蛋白的影响:安子合剂干预后,在ACA 阳性小鼠胎盘组织中共鉴定出49个差异蛋白,其中39个差异蛋白显著上调,10个显著下调。生物信息学分析发现这些差异蛋白主要定位于细胞核,参与核酸结合,与细胞周期进程和脂质生物合成过程相关,其中10个蛋白存在相互作用;Western blot结果表明,与空白对照组比较,这些差异蛋白均在模型组胎盘中表达上升(P<0.05),安子合剂干预后这些蛋白表达均有所下降(P<0.05),其中差异蛋白Tim-3下降最为明显,为模型组的1/4。3.安子合剂对降低小鼠胎盘Tim-3和Th1/Th2比值的影响:与模型组相比,安子合剂低剂量组、安子合剂高剂量组均能显著降低Tim-3表达,减少Th1细胞数、增加Th2细胞数、降低Th1/Th2比值(P<0.05或P<0.01);安子合剂低剂量组在降低Tim-3表达、减少Th1细胞数、增加Th2细胞数、降低Th1/Th2比值方面,效果显著优于阿司匹林组(P<0.05或 P<0.01)。4.安子合剂临床疗效及通过Tim-3对Th1/Th2平衡的影响:安子合剂治疗后不仅能有效改善患者的临床症状,治疗组中医证候疗效和综合疗效均明显优于对照组(P<0.05),而且能有效降低血清ACA水平,有效降低Tim-3水平,有效减少Th1细胞数、增加Th2细胞数、降低Th1/Th2比值,降低Th1(IL-2、IFN-γ)细胞因子、升高Th2(IL-6、IL-10)细胞因子,治疗组各项指标均明显优于阿司匹林对照组(P<0.05)。结论:临床试验表明,安子合剂治疗ACA 阳性流产患者,临床疗效显著,不仅能明显改善患者临床症状,还能有效降低患者血清ACA水平,并通过抑制血清Tim-3水平来降低Th1/Th2比值;动物实验表明,安子合剂的安胎作用机制可能与药物影响ACA 阳性流产小鼠胎盘组织中大量差异蛋白表达(39个差异蛋白上升,10个差异蛋白下降),抑制胎盘Tim-3水平,降低血清和胎盘中ACA和TNF-α含量,减少血清Th1细胞数、增加Th2细胞数、降低Th1/Th2的比值,维持母胎界面Th1/Th2的免疫平衡,达到避免妊娠丢失的目的密切相关。