血管增生(angiogenesis，neovacularization)，即从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程。血管增生受血管增生促进因子和血管增生抑制因子调节，二者之间的失衡是包括肿瘤在内的病理性血管增生的病因。血管增生促进因子的表达上调和血管增生抑制因子的表达下降均能诱发血管增生，而且二者常常同时发生。 肿瘤的生长依赖于血管增生。肿瘤在新生血管长入前生长缓慢，一旦新生血管长入肿瘤即呈快速生长状态。而且，肿瘤细胞由新生血管进入血液循环是肿瘤侵袭转移的第一步。肿瘤血管增生对于肿瘤的生长与转移是最重要的因素。因此，以肿瘤血管增生为靶点正成为治疗包括恶性肿瘤在内的血管增生性疾病的研究热点。 色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderived-factor，PEDF)在细胞实验和体内实验上均显示是一种强的血管增生抑制因子。文献报道PEDF作用较其它的已知的血管增生抑制因子都要强，是目前已知的活性最强的血管增生抑制因子。PEDF能抑制血管内皮细胞的增殖迁移以及低氧诱导的视网膜血管增生，而对于肿瘤生物治疗的实验研究还处于起步阶段。 1.研究目的：由于直接从人体中分离纯化PEDF难度较大，因此本研究采用基因克隆和重组表达技术，在原核表达载体pET22b、pET28a和pET30a中构建表达人PEDF，优化表达和纯化条件，以期获得具有生物学活性的重组人PEDF的高效表达；建立裸鼠肿瘤皮下种植模型，观察rPEDF在体内体外实验中对于肿瘤的影响，探索寻找治疗肿瘤的新手段和新策略。 2.研究方法：①根据已知的GeneBank中人PEDFcDNA成熟蛋白质编码区序列(AF400442，nt128-nt1327)设计特异性引物，以人视网膜cDNA文库为模板，经PCR扩增人PEDF基因，定向克隆至原核表达载体pET-22b中；转化大肠杆菌BL21(DE3)以建立表达人PEDF重组融合蛋白的工程菌株；IPTG诱导表达PEDF，经变性复性后获得可溶性重组蛋白；细胞实验鉴定其活性。②以构建的重组质粒pET22b/PEDF为模板，PCR扩增人PEDF基因，定向克隆至原核表达载体pET28a和pET30a中；转化大肠杆菌BL21(DE3)以建立表达人PEDF重组融合蛋白的工程菌株；IPTG诱导表达PEDF，可直接获得可溶性重组蛋白；细胞实验鉴定其活性。③MTT法检测rPEDF对人胃癌细胞系细胞SGC7901、人宫颈癌细胞系细胞HeLa和人鼻咽癌细胞系细胞CNE-2增殖的影响；流式细胞仪检测rPEDF对SGC7901、HeLa和CNE-2细胞凋亡的影响。④建立裸鼠肿瘤皮下种植模型；检测rPEDF对肿瘤生长的影响；绘制生长曲线，测量瘤重，计算抑瘤率。 3.研究结果：①PCR、酶切鉴定和测序结果表明：本研究成功构建了人PEDFcDNA成熟蛋白质编码区序列的原核表达载体pET22b/PEDF，IPTG诱导表达重组蛋白，经变性复性可获得可溶性PEDF，产量约为每升10mg；重组人PEDF能细胞特异性抑制内皮细胞的增殖，特异性地促进内皮细胞的凋亡，证实其具有天然蛋白质的活性。②PCR、酶切鉴定和测序结果表明：本研究成功构建了人PEDFcDNA成熟蛋白质编码区序列的原核表达载体pET28a/PEDF和pET30a/PEDF，IPTG诱导表达重组蛋白，可直接获得可溶性PEDF，产量约为每升12mg；重组人PEDF能细胞特异性抑制内皮细胞的增殖，特异性地促进内皮细胞的凋亡。③rPEDF对人胃癌细胞系细胞SGC7901和人宫颈癌细胞系细胞HeLa的增殖和凋亡无影响。rPEDF抑制人鼻咽癌细胞系细胞CNE-2细胞的增殖，其抑制作用随着rPEDF浓度的增加而增大，呈明显的浓度依赖关系，EC50约为600nmol/L。rPEDF促进CNE-2细胞的凋亡，且随着rPEDF浓度的增加而增大，呈明显的浓度依赖关系。④动物实验证实了PEDF具有抑制肿瘤生长的效应。 4.结论：①获得了可以表达人PEDFeDNA成熟蛋白质编码区序列的大肠杆菌工程菌株：pET22b/PEDF-BL21(DE3)，建立了从不溶性包涵体中获得具有生物学活性的可溶性重组蛋白的方法。②获得了可以表达人PEDFeDNA成熟蛋白质编码区序列的大肠杆菌工程菌株：pET28a/PEDF-BL21(DE3)和pET30a/PEDF-BL21(DE3)，建立了从可溶上清中获得具有生物学活性的可溶性重组蛋白的方法。③rPEDF具有抑制肿瘤生长的功能，其作用是通过两个环节起作用的：1)它通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移，促进内皮细胞的凋亡，阻止肿瘤新生血管生成从而抑制肿瘤生长。2)它也通过抑制部分肿瘤细胞(鼻咽癌细胞)的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，从而延缓肿瘤生长。 本研究所建立的表达人PEDF的大肠杆菌工程菌株为将来进一步深入研究PEDF治疗包括肿瘤在内的血管增生性疾病及其机制提供了必备的物质基础。