作为工业上应用最为广泛的微生物之一,氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)有独特的不完全氧化多羟基类化合物的能力,可以生成相应的醛类、酮类或酸类,在维生素C、米格列醇、二羟基丙酮等生产工艺中起着重要作用。本研究室多年来一直开展有关氧化葡萄糖酸杆菌的研究工作,取得了很多研究成果。然而这些研究大都集中在对氧化葡萄糖酸杆菌野生型菌株和野生型蛋白的研究,随着时代的发展和工业化应用的要求,通过结构指导对酶的改造进行理性设计是发展趋势,而本研究室也积累了一些结构生物学和计算生物学的技术方法和研究成果,故本论文着眼于氧化葡萄糖酸杆菌中关键氧化还原酶的结构及底物与辅酶选择性的研究,期望打造一个基于结构指导的氧化还原酶的理性设计平台。下面从三个方向介绍一下具体研究内容。第一,氧化葡萄糖酸杆菌中烯酮还原酶Gox0502的结构解析及功能研究烯酮还原酶(Enoate reductase, ERs)属于Old yellow enzyme家族,能够立体选择性还原α,p不饱和羰基化合物中的碳碳双键,并引入两个手性中心。该酶广泛存在于细菌、真菌以及植物中。因为其重要的空间选择的催化特性,烯酮还原酶成为生物催化领域研究的热点之一。本研究室曾于2008年在氧化葡萄糖酸杆菌中筛选鉴定出两个编码烯酮还原酶的基因,分别是gox0502和gox2684。本文中我们解析了Gox0502的三维结构并构建了Gox0502与FMN、香芹酮复合物的结构模型；根据Gox0502的三维结构,鉴定了其催化活性位点,而相应的定点突变实验也证实了这些；根据Gox0502的三维结构及复合物模型,发现Trp66和Trp100是活性中心附近的两个关键氨基酸。针对它们设计了相应的定点突变实验,实验结果发现Trp66和Trp100在产物的非对映异构选择性中起到了重要的作用。第二,氧化葡萄糖酸杆菌中醛还原酶Gox2253的结构解析及功能研究氧化葡萄糖酸杆菌细胞质内含有大量的短链脱氢酶／还原酶(short-chain dehydrogenase/reductase, SDR),它们的功能多种多样,在碳水化合物、氨基酸、脂类等物质代谢过程中起到了关键作用。同时,SDRs在生物催化领域比如不对称还原、碳氮双键还原、脱卤素、脱羧基等反应中有很好的产业化应用前景。氧化葡萄糖酸杆菌中的SDR家族蛋白Gox2253被鉴定为醛还原酶,被认为能够降解细胞内多余的醛类而具有解毒功能。因此对Gox2253的结构生物学研究不仅有助于揭示SDR家族酶的催化机制及底物和辅酶选择性,而且可以增加对氧化葡萄糖酸杆菌胞内中间体代谢的认识。我们解析了Gox2253的三维结构并构建了Gox2253与NADPH/NADH、底物复合物的结构模型；根据Gox2253的三维结构,鉴定了其催化活性位点,而相应的定点突变实验也证实了这些；根据Gox2253的三维结构及复合物模型,研究了其底物选择性的机理；根据Gox2253的三维结构及复合物模型结合计算生物学和分子动力学模拟揭示了其辅酶偏好性的机理,通过单个氨基酸残基的定点突变(R42K/Y)改造了Gox2253的辅酶选择性,使得严格依赖NADPH的Gox2253转变为既可以利用NADPH也可以利用NADH的醛还原酶。第三,氧化葡萄糖酸杆菌中醛脱氢酶Gox0499的结构解析及功能研究氧化葡萄糖酸杆菌中含有五个编码乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)家族的基因,这些蛋白对于细胞质中的代谢过程非常重要,另外在醛类及其衍生物的解毒机制中起到作用。Gox0499就是其中之一,我们解析了Gox0499的三维结构,为了深入研究Gox0499的辅酶选择性机制,我们同时还解析了另外一个ALDH家族蛋白琥珀酸半醛脱氢酶Sp2771及Sp2771与底物辅酶复合物的三维结构；通过对Gox0499和Sp2771的结构生物学分析,揭示了这两个ALDH家族蛋白的底物选择机制；通过Gox0499、Sp2771与底物辅酶复合物的三维结构分析,我们发现一个氨基酸残基(Gox0499中的Pro159、Sp2771中的Ser157)在ALDH辅酶选择性中起到了关键作用；相应的定点突变及催化实验结果证实了我们的推测：通过引入S157E的突变,Sp2771的辅酶选择性逆转,由NADP+转变为NAD+；引入P159E的突变后,Gox0499利用NAD+的活性明显高于利用NADP+的,引入P159S的突变后,Gox0499利用NADP+的活性明显高于利用NAD+的活性。通过这两个酶的辅酶选择性的改造,我们初步构建了由结构生物学指导的氧化还原酶辅酶选择性方面改造的平台,可以针对更多的氧化还原酶进行定向进化。