Bacillomycin D是枯草芽孢杆菌分泌的一种抗菌脂肽。Bacillomycin D含有多种同系物,虽然结构很早就已经被鉴定出来,但至今还没有纯品销售。在自然条件下,枯草芽孢杆菌中bacillomycin D的含量较低。营养代谢在微生物细胞生长、代谢产物的合成和调控等方面发挥重要作用。通过营养代谢显著改善枯草芽孢杆菌合成抗菌脂肽日渐成为国内外学者的研究焦点。赭曲霉是一种丝状真菌,它所产的赭曲霉毒素A(OTA)具有肾毒性、致畸性和致癌性。赭曲霉在食品中广泛存在,可污染食品,对人类的健康构成严重威胁。Bacillomycin D具有很强的抗真菌活性,在食品防腐方面具有很好的发展前景。本论文主要研究bacillomycin D的纯品制备和检测方法,探索高效合成bacillomycin D营养代谢机制及补料分批发酵策略,探讨bacillomycin D对赭曲霉的抗真菌模式及机理,研究bacillomycin D对OTA的合成的影响,在人工模拟贮藏条件下评估bacillomycin D控制粮食中赭曲霉污染的应用效果。旨在提高bacillomycin D产量,为将来扩大bacillomycin D的工业化生产和开发新型防腐剂奠定基础和提供技术参考。主要研究结果分述如下:1.Bacillomycin D纯品制备及检测方法的建立利用基因检测法分析B.subtilis fmbJ中是否含有bacillomycin D合成酶基因簇,将扩增出的一段880bp序列进行同源比对,发现该序列与bacillomycinD合成酶C基因簇的同源性达到99%,B.subtilis fmbJ含有bacillomycin D合成酶C基因簇,具有合成bacillomycin D的潜力。通过盐酸沉淀、甲醇萃取、柱层析和RP-HPLC分离纯化获得bacillomycin D。HPLC-MS-MS分析可知,bacillomycin D的纯度达到95%。Bacillomycin D中有11个活性峰,均含有7肽结构:-Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr-,分别为bacillomycin D的C14、C15、C16、C17同系物。以bacillomycin D纯品为标准品,建立了bacillomycin D的检测方法。2.菊糖高效合成bacillomyicn D的调控机制研究了不同糖组分对bacillomycin D合成的影响,菊糖能显著提高B.subtilisfmbJ合成bacillomycin D的能力。采取补料分批发酵菊糖进一步提高了bacillomycin D的产量。Bacillomycin D产量随生物量的提高而增加。当在60h进行菊糖补料时,bacillomycin D的产量和产率最大达到1227.49mg/L和10.23mg/L.h,与分批发酵相比,分别提高了3.12和3.55倍。利用RT-PCR分析了菊糖对bacilomycin D合成相关酶基因和信号蛋白表达的影响,阐明了菊糖促进B.subtilisfmbJ高效合成bacillomycin D的分子机制。菊糖能显著促进bacilomycin D合成酶基因BYA、BYB、BYC和TE的表达,bacilomycin D合成酶基因表达水平的提高促进了bacilomycin D的合成。菊糖能显著上调ComA,DegU,δH和Spo0A的表达,ComA,DegU,δH和Spo0A表达量的提高利于形成更多芽孢和增强bacillomycin D合成酶的转录活性,因而促进了bacillomycin D的合成。3.L-gln高效合成bacillomyicn D的调控机制探讨了20种常见氨基酸对bacillomycin D合成的影响。结果表明L-arg、L-met、L-thr、L-trp、L-pro、L-asn和L-gln能促进B.subtilisfmbJ合成bacillomycin D,其中,L-gln能显著增强B.subtilisfmbJ合成bacillomycin D,得到的bacillomycin D产量最高,达到了165.25mg/L。L-ser、L-tyr、L-ala、L-phe、L-ile、L-lys、L-leu和L-val不利于bacillomycin D的合成,而L-asp和L-cys则能完全抑制bacillomycin D的合成。采取补料L-gln分批发酵进一步提高了bacillomycin D的产量,当在66h进行补料时,bacillomycin D的产量和产率达到987.52 mg/L和8.26 mg/L.h。研究了L-gln对bacilomycin D合成酶基因表达的影响。进一步研究发现,L-gln能显著上调BYA、BYB、BYC和TE的表达,这些基因表达水平的提高促进了bacillomycin D的合成。当以L-gln为氮源时,DegU、δH和Spo0A对bacillomycin D的合成起正调控作用,而AbrB对bacillomycin D的合成起负调控作用,而ComA和PhrC对bacillomycin D的合成影响不大。4.金属盐及其它因素对bacillomyicn D合成的影响研究了Li+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+对bacillomycin D合成的影响。结果表明Ca2+、Mg2+和Na+能显著提高bacillomycin D产量。Ca2+、Mg2+和Na+的不同金属盐对bacillomycin D的合成能力不同。L-乳酸钙优于CaCl2,MgSO4.7H2O优于MgCl2,NaCl优于Na2CO3.L-乳酸钙最适合产bacillomycin D的金属盐。L-乳酸钙是最适合产bacillomycin D的金属盐。确定摇瓶发酵生产bacillomycin D的较适宜条件为:酵母膏3g/L,发酵时间为120h,温度为33℃,初始pH7.0和接种量5%。5.Bacillomyicn D高效合成因子优选及多轮补料分批发酵通过Plackett-Burman设计法和响应面分析,发现,酵母膏、菊糖和发酵时间对bacillomycin D产量影响极显著,得出了bacillomycin D高效合成的最佳工艺参数:酵母膏4.52g/L,菊糖42.62g/L和发酵时间137.5h,在此条件下,得到的bacillomycin D产量为1014.92 mg/L。通过优化组合,获得bacillomyicn D高效合成培养基(YIGL培养基)配方:酵母膏4.52g/L,菊糖42.62g/L,L-Gln5g/L,L-乳酸钙7g/L。和landy培养基相比,YIGL培养基能显著提高bacillomycin D的产量。YIGL培养基能上调了BYA、BYB、BYC和TE的表达,增强bacillomycin D合成酶转录活性,显著提高bacillomycin D的合成能力。为了进一步提高bacillomycin D的合成能力,通过控制发酵液DO和测定生物量的变化确定一轮、两轮、三轮和四轮补料分批发酵策略,采用该策略进行补料分批发酵,能显著提高bacillomycin D的产量,其中三轮补料分批发酵获得的bacillomycin D产量和生物量最大,分别达到3.26g/L和76.34g/L。6.Bacillomyicn D的赭曲霉抑菌模式研究研究了bacillomycinD对赭曲霉菌丝和孢子生长的影响,结果表明,30μg/mL的bacillomycin D能完全抑制菌丝和孢子生长,赭曲霉的MIC和MFC分别为30μg/mL和90μg/mL。Bacillomycin D能使赭曲霉菌丝产生变形、扭曲,破坏细胞壁和细胞膜,能与赭曲霉基因组DNA结合并破坏基因组DNA,使细胞膜离子通透性增加,造成核酸和蛋白质发生泄漏。Bacillomycin D能导致赭曲霉细胞凋亡。当采用25μg/mL bacillomycin D处理赭曲霉细胞1和2h时,细胞损伤率由73.7%增加至92.07%。研究了bacilomycin D引起赭曲霉细胞凋亡的因素:ROS的产生和hsp70的表达情况。Bacillomycin D能促进的H2O2产生和减弱赭曲霉抑制产O2-和.OH,当添加25μg/mL bacillomycin D培养7d时,产生的H2O2比对照增加了30.22倍,而O2-抑制量和.OH抑制量分别比对照下降了486.85 U/g蛋白和375.2 U/mg蛋白。H2O2、O2-和.OH的累积是导致赭曲霉细胞凋亡的原因之一。Bacillomycin D对hsp70的表达具有上调作用,hsp70表达量的提高能减缓bacillomycin D对赭曲霉细胞的损伤。7.Bacillomyicn D对OTA的抑制作用及在粮食贮藏中的应用Bacillomycin D能通过抑制赭曲霉的生长来抑制OTA合成,bacillomycin D浓度越高,抑制效果越明显。Bacillomycin D能通过下调赭曲霉pks基因的表达、降低OTA合成酶的转录活性来抑制OTA合成。人工模拟粮食贮藏实验结果表明bacillomycin D能有效控制粮食中的赭曲霉污染。当采用90μg/g bacillomycin D,控制谷物水分含量16%、湿度14%和贮藏温度25℃时,能完全抑制大米和燕麦中赭曲霉的生长和OTA的产生。当没有经过bacillomycin D处理时,被赭曲霉侵染的大米和燕麦的H2O2和O2-明显增加,CAT、GPX和SOD活性也较高。CAT、GPX和SOD活性的升高利于清除多余的H2O2和O2-。当经过bacillomycin D时,大米和燕麦中的CAT、GPX和SOD活性显著降低,同时,H2O2和O2-也明显降低。Bacillomycin D能显著降低大米和燕麦中活性氧水平,能防止大米和燕麦因脂质过氧化而引起品质劣变。