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丝状真菌是具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统,能对蛋白质进行翻译后修饰,如蛋白质糖基化等,并且比植物、昆虫和哺乳动物细胞具有更快的生长速率。近年来,随着真菌分子遗传技术和菌种改良策略的进步,尤其是真菌基因组学的发展,利用丝状真菌生产内外源蛋白越来越受到关注。但是蛋白酶降解和分泌不足限制了蛋白质的产量。为控制蛋白酶降解,提高外源蛋白产量,本论文通过同源重组的方法分别阻断黑曲霉中与降解相关的两个基因apsB和ptrB,研究其对内外源蛋白表达分泌的影响。apsB是一种赖氨酸氨肽酶基因,其编码的蛋白酶ApsB具有识别并切除多肽N-端赖氨酸残基的功能。以黑曲霉apsB基因检索其它物种的全基因组序列,发现其与Neosartorya fischeri及Aspergillus fumigatus具有83%同源序列,与Aspergillus clavatus同源性为82%,与Aspergillus oryzae、Aspergillus terreus及Aspergillus nidulans具有81%同源序列。目前尚没有黑曲霉apsB和ptrB编码蛋白的生化特性和其功能的相关报道。ptrB基因编码的蛋白是一种运输短肽的跨膜蛋白,在曲霉属的Aspergillus fumigatus及Aspergillus nidulans中也能找到ptrB基因,并且具有很高的同源性。本论文首先根据apsB和ptrB基因序列设计引物,以黑曲霉菌株GICC2773基因组DNA为模板PCR扩增相应的基因片段,连接到克隆载体pBS-T或pUCm-T。其次在基因片段中间插入选择标记hph或amdS表达盒,分别构建成基因阻断质粒pBSΔapsB-amdS和pUCmΔptrB-hph。随后两阻断质粒经酶切分别产生被选择标记阻断的相应基因片段,并采用原生质体-PEG法转化已整入外源蛋白漆酶表达质粒的黑曲霉菌株GICC2773。产生的转化子经PCR检测,筛选到apsB基因阻断菌株ΔapsB#28、ΔapsB#93和ptrB基因阻断菌株ΔptrB#33。最后测定这些阻断菌株内源蛋白葡萄糖淀粉酶/a淀粉酶及外源蛋白漆酶的活性,以分析对应基因的阻断对内外源蛋白表达分泌的影响。测定结果显示,apsB基因的阻断明显改善了内源蛋白葡萄糖淀粉酶及外源蛋白漆酶的表达分泌。在ΔapsB#28、ΔapsB#93中,漆酶分泌活性分别提高45-59.2%、34-39.2%,葡萄糖淀粉酶活性分别提高77-85.2%、36.6-47%。在ΔptrB#33中,漆酶分泌活性降低了了5.2%,a淀粉酶活性基本没有变化。另外,本研究还对apsB基因阻断质粒对黑曲霉A12进行了多次转化,虽然得到超过500个转化子,却未能筛选到一个以A12为受体的apsB基因阻断突变株。此处活性提高%采用平均值计算。