论文部分内容阅读
目的:根据中医“肾阳虚”和体质学说的理论内涵,设计构建肾阳虚体质大鼠模型,并通过评价模型大鼠棕色脂肪线粒体产能状态,研究下丘脑对棕色脂肪的调控机制验证肾阳虚体质模型造模成功,为中医肾阳虚及其体质研究提供一种适宜的实验动物模型。方法:(1)参照肖小河动物温度趋向性行为学智能检测系统原理搭建动物寒热趋向装置,根据中医“阳虚则寒”的理论筛选偏阳虚的老龄雌雄鼠作为亲本并交配传代,对孕鼠施以猫吓鼠“恐伤肾”、低温“寒伤阳”和黄柏水灌胃造模直至幼鼠出生,构建肾阳虚体质大鼠模型。(2)采用动物寒热趋向装置评价模型组和对照组幼鼠寒热趋向,并比较模型组和对照组的幼鼠出生体重,初步评价造模成功。(3)采用透射电镜观察各组棕色脂肪组织切片中线粒体超微结构,研究肾阳虚体质大鼠线粒体组织结构状态。(4)采用ELISA法测量各组脊间棕色脂肪ATP浓度,western blot法测定棕色脂肪组织中complex1-5浓度,研究肾阳虚体质大鼠模型棕色脂肪线粒体产能状态。(5)采用ELISA法测量各组棕色脂肪iNOS浓度,western blot法测定棕色脂肪组织中Fis-1/Drp-1,LC3a/LC3b和Opa-1浓度,研究棕色脂肪组织线粒体自身健康状态。(6)采用RT-PCR法测定各组棕色脂肪PGC-1α/AMPK-α2/UCP-1表达量,同法测定下丘脑NPY/NPY1R和POMC/MC4R表达量,研究肾阳虚体质大鼠下丘脑对棕色脂肪线粒体产能状态的调控机制。结果:(1)子代肾阳虚体质组幼鼠出生体重低于对照组,具有显著组间差异(P<0.01);相比于对照组雄鼠,子代肾阳虚体质组雄鼠在40℃温控板上的停留率呈增高的趋势(P>0.05)。(2)与亲本母鼠组和对照组相比,子代肾阳虚体质组雌鼠与雄鼠棕色脂肪线粒体超微结构均显著偏弱,线粒体肿胀程度较严重,线粒体嵴排列稍紊乱,嵴断裂较多。(4)与亲本母鼠组相比,子代肾阳虚体质组棕色脂肪ATP浓度降低(P<0.05),complex-1浓度显著降低(P<0.01),complex-4浓度极显著降低(P<0.001);其中,子代肾阳虚体质组雄鼠complex-1,4浓度显著降低(P<0.01),子代肾阳虚体质组雌鼠ATP浓度和complex-1浓度降低(P<0.05)、complex-4浓度显著降低(P<0.01)。与对照组雄鼠相比,子代肾阳虚体质组雄鼠棕色脂肪complex-1浓度极显著降低(P<0.001);与对照组雌鼠相比,子代肾阳虚体质组雌鼠棕色脂肪complex-1显著降低(P<0.01)。(5)与亲本母鼠组相比,子代肾阳虚体质组棕色脂肪iNOS浓度、Fis-1/Drp-1浓度和LC3a/LC3b浓度均升高(P<0.05),Opa-1浓度极显著降低(P<0.0001);其中,子代肾阳虚体质组雄鼠iNOS浓度显著升高(P<0.01),Opa-1浓度显著降低(P<0.001);子代肾阳虚体质组雌鼠Opa-1浓度显著降低(P<0.01)。与对照组雄鼠相比,子代肾阳虚体质组雄鼠iNOS浓度升高(P<0.05),Opa-1浓度降低(P<0.05);与对照组雌鼠相比,子代肾阳虚体质组雌鼠棕色脂肪Opa-1和Drp-1浓度显著降低(P<0.01)。(6)与亲本母鼠组相比,子代肾阳虚体质组雄鼠NPY表达量升高(P<0.05)。与对照组雄鼠相比,子代肾阳虚体质组雄鼠NPY表达显著升高(P<0.01),PGC-1α表达显著降低(P<0.01);与对照组雌鼠相比,子代肾阳虚体质组雌鼠UCP-1浓度升高(P<0.05)。结论:(1)肾阳虚体质模型鼠ATP产能下降,畏寒怯冷和低体重儿比例增加与肾阳虚体质临床表征相符,从宏观上论证造模成功。(2)肾阳虚体质模型鼠呼吸链酶代谢异常,呼吸链复合酶complex-1是评价肾阳虚体质模型能量代谢低下的关键指标之一。(3)肾阳虚体质模型鼠下丘脑作为线粒体能量代谢上游调控靶器官抑制了能量代谢,不仅使模型鼠能量代谢呈下降趋势,且从微观上论证造模成功。(4)肾阳虚体质大鼠棕色脂肪线粒体裂变和融合的自稳态失衡可作为肾阳虚模型构建成功的病理指征。(5)子代雌雄肾阳虚模型鼠存在肾阳虚性状差异,性激素是否促进或拮抗了造模因素,尚待进一步验证。