目的:肝脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion,I/R)是临床常见的病理生理过程,在肝移植、肝叶切除、失血性休克中,肝I/R几乎不可避免,通常导致肝功异常甚至肝功衰竭,是围术期麻醉管理的重要难题。肝I/R的影响因素众多,可能与肝细胞内活性氧生成增多,Kupffer细胞和中性粒细胞活化,NO超载,细胞因子及粘附因子释放有关,但其机制尚不十分清楚,因此,深入研究I/R的发生机制,对减轻或消除I/R,指导麻醉管理,改善患者预后具有重要意义。大量研究显示,核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路是HIRI的主要机制之一。在细胞静息状态下,NF-κB与其抑制蛋白(inhibitoryκB,IκB)结合,以非活性形式存在于胞质中。当细胞处于应激或受到微生物、病毒、促炎因子等刺激,IκB激酶(IκB kinase,IKK)磷酸化(p-IKK)被激活,催化IκB磷酸化,进而蛋白降解。游离的NF-κB成为活化状态,进入细胞核调控免疫相关受体、细胞因子、粘附分子等靶基因的转录,引起组织损伤。因此,调控NF-κB信号通路活性对减轻HIRI具有重要意义。近期研究显示,NF-κB的靶蛋白之一锌指蛋白A20能够选择性反馈抑制NF-κB信号通路的活化,对肾脏、肝脏等多种器官的缺血再灌注损伤具有保护作用。但其中调控机制尚未见报道。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lnc RNAs)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,通常无法编码蛋白质。然而,lnc RNA具有与细胞凋亡、炎症和自噬相关的生物学功能。也有研究表明,lnc RNA在肝I/R损伤中所扮演的重要角色,并有望通过调节lnc RNA的表达为肝I/R损伤的预防及治疗提供潜在的靶点。lnc RNA HOX转录反义RNA(HOTAIR)作为一种促癌基因参与多种肿瘤的发生发展。然而目前关于lnc RNA-HOTAIR在肝I/R损伤中所扮演的角色尚无报道,据报道,lnc RNA HOX转录反义RNA(HOTAIR)通过增加肝细胞癌自噬相关基因7(ATG7)的表达水平来激活自噬。然而,HOTAIR是否调节肝细胞I/R损伤的自噬仍不清楚。因此,本研究通过大鼠肝脏缺血再灌注损伤及细胞缺氧复氧模型,初步观察了lnc RNA-HOTAIR在其中的作用,并对其在此过程中的调控自噬分子机制进行了探讨。材料与方法:1、应用无创微血管夹夹闭大鼠左、中叶肝蒂,构建大鼠左半肝缺血再灌注损伤模型。2、大鼠肝脏BRL3A细胞系由中科院上海生命科学研究院提供。3、光镜及透射电子显微镜下观察大鼠肝脏病理形态。4.利用制作病理切片观察小鼠肝脏缺血再灌注模型的细胞情况5、应用ELISA方法对血清样本中肝功酶及促炎因子含量进行检测。6、采用Western blot检测蛋白的表达。7、采用台盼蓝拒染法测定细胞活力。8、采用流式细胞仪PI染色检测细胞凋亡。9、采用质粒转染技术干预体外实验小鼠肝脏细胞中基因表达水平。10、采用荧光素酶检测HOTAIR与miR-20b-5p的结合位点分子机制。11、统计学处理:每次实验重复3次,数据以x±s表示,采用SPSS13.0软件进行t检验。实验结果:实验一:大鼠左半肝缺血1 h,再灌注1 h后,肝脏细胞开始出现肿胀、凋亡,血清AST、ALT水平开始升高,血清TNF-α、IL-6含量明显增加,并随再灌注时间的延长而逐渐加剧,再灌注6 h时达到峰值,炎症因子水平的上调与病理生理改变基本相符。再灌注1 h后p-IKK蛋白表达显著增加,6 h开始下调,至再灌注24h时基本恢复正常,与大鼠血清肝功酶、炎症因子及肝脏病理损伤严重程度基本一致,而IKK水平在缺血再灌注前后无明显变化。大鼠肝脏缺血再灌注1 h后Itch和A20表达开始轻度上调,随再灌注时间延长表达逐渐增加,至再灌注24 h达峰值,并随着Itch和A20表达的不断增加,p-IKK蛋白表达明显受到抑制。实验二:通过大鼠肝脏细胞缺血再灌注损伤模型,进一步阐明了NF-κB信号通路在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的活性变化。阐明缺血再灌注损伤中NF-κB信号的变化,对再灌注不同时间后大鼠肝脏细胞IKK、p-IKK表达进行检测,结果显示,再灌注1 h后p-IKK表达显著增加,6 h开始下调,到24 h时基本恢复正常。而IKK水平在缺血再灌注前后无明显变化。实验三:通过研究表明HOTAIR在I/R肝脏中表达增加并直接靶向调控miR-20b-5p。此外,我们通过与ATG7 mRNA的3’UTR结合,明确ATG7是miR-20b-5p的抑制靶点。通过补救实验,我们发现HOTAIR通过miR 20b-5p/ATG7结论:1、本研究建立大鼠半肝缺血再灌注损伤模型的方法可行,大鼠血清肝功酶及炎症因子水平的变化与肝脏病理损伤严重程度的改变基本一致。2、大鼠肝缺血再灌注后,p-IKK表达上调,其表达水平的改变与血清肝功酶、炎症因子水平的变化及肝脏病理损伤严重程度的改变趋势基本一致,进一步证实NF-κB信号通路是HIRI的重要机制之一。3、大鼠肝细胞缺血再灌注后,lnc RNA-HOTAIR表达上调;过表达lnc RNA-HOTAIR的BRL3A细胞,经缺氧复氧处理后,较空载体转染组,p-IKK表达显著减少,表明lnc RNA-HOTAIR能够抑制缺氧复氧后肝脏细胞内NF-κB信号通路的激活,对大鼠肝细胞具有保护作用。4、过表达lnc RNA-HOTAIR的BRL3A细胞,经缺氧复氧处理后,较空载体转染组,细胞死亡率及凋亡发生率均显著降低,表明lnc RNA-HOTAIR能够抑制缺氧复氧后肝脏细胞的死亡及凋亡,对大鼠肝细胞具有保护作用。5.在肝细胞体外缺氧模型中发现HOTAIR表达上调且自噬水平升高。6.在肝细胞中miR-20b-5p可通过靶向结合ATG7 3’UTR参与抑制ATG7表达。7.在肝细胞体外缺氧模型中验证HOTAIR通过靶向抑制miR-20b-5p上调ATG7表达影响缺氧肝细胞自噬水平,从而介导I/R损伤。轴调节自噬。我们的研究为HOTAIR在肝I/R损伤中调节自噬的作用提供了新的线。