论文部分内容阅读
背景与目的胃癌是世界范围内严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一,我国是胃癌的高发区,发病率、死亡率居高不下。胃癌的临床治疗以手术和化疗为主,但易出现复发和转移,患者5年生存率低。因此,寻找新的胃癌治疗途径是现阶段急需解决的难题。姜黄素是从姜黄中提取出的一种相对分子质量368.39的多酚类化合物,已有的研究显示姜黄素具有抑制炎症反应、抗氧化、抗类风湿、抗感染的作用,并在胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤等多种肿瘤疾病中发挥抑癌作用。随着研究的日益深入,姜黄素的抗肿瘤作用得到广泛重视,但其在肿瘤疾病中的作用机制有待进一步探索。在肿瘤机制方面的研究中,microRNAs的作用受到广泛关注。miRNA通过介导mRNA的降解和阻遏翻译下调靶基因的表达,参与体内多种基本信号传导途径,包括重要肿瘤癌基因或抑癌基因的表达。研究发现姜黄素的类似物EF24可通过上调miR-33b的表达抑制黑色素瘤细胞的迁移能力。但二者在胃癌中是否存在类似的作用尚不十分清楚。XIAP是细胞凋亡抑制蛋白（IAP）基因家族成员之一,具有抑制天门冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶活性和细胞凋亡的能力,在多种类型的肿瘤中异常表达。有研究表明在胃癌中下调XIAP的表达可诱导细胞凋亡。本研究拟探索姜黄素对胃癌细胞中miR-33b和XIAP表达的影响,进而分析miR-33b和XIAP之间的靶向关系,丰富和完善姜黄素发挥抗肿瘤作用的相关调控机制。方法1.在37℃,5%CO2培养箱中培养正常胃上皮细胞GES-1,胃癌细胞BGC-823和SGC-7901。2.用二甲基亚砜溶解姜黄素,根据实验需求分别制备0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,15μmol/L,20μmol/L和40μmol/L浓度的姜黄素溶液。3.为研究不同浓度姜黄素对胃癌细胞增殖的影响,将细胞分为0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,15μmol/L,20μmol/L,40μmol/L浓度的姜黄素组,用CCK-8实验检测六组细胞的增殖情况。4.为研究不同姜黄素对胃癌细胞凋亡的影响,将姜黄素溶液梯度稀释为0μmol/L,5μmol/L,15μmol/L,20μmol/L,用不同浓度的姜黄素溶液对细胞进行处理,进而将细胞分成上述的四组,用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。5.用荧光定量PCR的方法分别检测0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,15μmol/L,20μmol/L和40μmol/L浓度姜黄素处理后胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中miR-33b和XIAP mRNA的表达水平。6.用Western blot的方法分别检测0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,15μmol/L,20μmol/L和40μmol/L浓度姜黄素处理后胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中XIAP蛋白的表达情况。7.运用Pearson相关性分析,分析细胞中mi R-33b和XIAP mRNA表达水平的相关性。8.以生物信息学方法分析并预测miR-33b的作用靶点。运用Overlap PCR的方法扩增野生及突变型XIAP的3’UTR区重组报告基因,利用Western blot实验和双荧光素酶报告实验验证miR-33b的作用靶点。9.为研究miR-33b表达上调对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,利用LipofectamineTM2000分别将脂质体复合物,mi R-33b mimic和miR-33bscramble转染入对数生长期的胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中,从而将细胞分为Blank组（空白对照组）,miR-33b mimic组和scramble组。用CCK-8实验检测三组细胞的增殖情况,用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。10.20μmol/L姜黄素处理与上调miR-33b和下调XIAP表达对胃癌细胞生物学作用效果的比较。利用Western blot检测各组胃癌细胞中XIAP蛋白的表达情况,应用CCK-8实验和流式细胞术比较各组胃癌细胞增殖和凋亡情况。11.回复实验。构建无3’UTR区XIAP表达载体,转染入胃癌细胞SGC-7901和BGC-823,利用Western blot检测XIAP蛋白的表达,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,分析姜黄素调控miR-33b对胃癌细胞产生生物学效应的作用机制。12.用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析,以α=0.05作为显著性检验标准。结果1.CCK-8实验检测结果显示姜黄素可抑制胃癌细胞增殖,且随剂量增加,增殖抑制作用愈加显著（P<0.05）。2.流式细胞术检测显示姜黄素可促进胃癌细胞凋亡,且随剂量增加,凋亡诱导作用更加明显（P<0.05）。3.荧光定量PCR和Western blot检测显示20μmol/L姜黄素处理后胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中miR-33b表达显著上调（P<0.05）,XIAP mRNA和蛋白表达均明显下调（P<0.05）,二者表达经统计学分析存在明显负相关性（R2=0.694,P<0.05）。4.生物信息学分析发现miR-33b和XIAP的3’UTR区存在互补结合区域,经Western blot检测发现mi R-33b表达上调时XIAP蛋白表达明显降低（P<0.05）,经双荧光素报告酶实验证实XIAP是miR-33b的靶基因。5.CCK-8实验和流式细胞术提示上调miR-33b的表达可抑制胃癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡（P<0.05）。6.20μmol/L姜黄素处理与上调mi R-33b和下调XIAP表达对胃癌细胞生物学作用效果的比较结果显示,三者分别作用于胃癌细胞XIAP蛋白表达均显著下调且产生相似的增殖抑制和凋亡促进作用（P>0.05）。7.回复实验结果显示无3’UTR区XIAP可回复20μmol/L姜黄素和上调miR-33b的表达对XIAP蛋白表达的抑制作用和胃癌细胞凋亡的促进作用。结论XIAP是miR-33b的下游作用靶点之一,姜黄素可通过上调mi R-33b的表达,抑制XIAP的表达,从而在胃癌细胞中发挥增殖抑制和凋亡促进作用。