研究背景恶性肿瘤代谢改变逐渐被认为是肿瘤发生发展过程中关键因素,早在1920年,德国生物化学家Otto Warburg就发现了肿瘤细胞代谢的特点,即高水平的糖酵解作用,并据此拿下了诺贝尔奖。肿瘤细胞用有氧糖酵解替代正常组织细胞的氧化磷酸化,这些不能经由线粒体途径获得ATP的肿瘤细胞,只能进行代谢重组,以维持细胞内的ATP和NADH水平正常,进行“低效但快速”的能量供给以支持自身的生存,增殖以及转移。此效应现已得到深入研究,且这种代谢差异已应用于PET-CT显像中。18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-2-fluro-D-deoxy-glucose, 18F-FDG,)是葡萄糖的类似物,其进入细胞内形成6-P-18FDG,6-P-18FDG不能被进一步分解,而滞留堆积在细胞内,故细胞对18F-FDG的摄取量与其葡萄糖代谢率成正比。PET-CT利用18F-FDG作为葡萄糖代谢示踪剂,因恶性肿瘤部位18F-FDG聚集异常增加,从而通过病灶对显像剂的摄取来反映其代谢变化,为临床提供疾病的生物代谢信息。除了有氧糖酵解之外,肿瘤细胞另一个重要的代谢特征即为脂肪酸合成(lipogenesis)的增加,肿瘤的发生与进展均与自身细胞内脂肪酸的从头合成相关。正常情况下,细胞主要从胞外摄取脂肪酸并将其转化为甘油三酯,以提供机体的能量储备。然而在肿瘤细胞中,尽管外源性的脂肪酸供给充足,肿瘤细胞极少利用其进行甘油三酯的储备,而主要依靠糖酵解产物丙酮酸进行内源性的脂肪酸合成,不同类型的肿瘤细胞可自身合成多达95%的饱和或单不饱和脂肪酸。但是相较于糖代谢,对恶性肿瘤细胞脂肪代谢的研究尚未深入。结肠癌作为全球常见恶性肿瘤之一,每年近100万人被诊断为新发病例,其中一半将死于结肠癌。结肠癌成为了全球第四致死性恶性肿瘤。大部分散发的结直肠癌经腺瘤癌变而来,据统计,95%的结直肠癌患者将获益于疾病的早期诊断。结直肠癌的早期诊断大致可分为两类,其一是非侵入性的检查,例如血常规,血清肿瘤标记物,粪便常规,影像学等检查手段等；另一类便是内镜检查,内镜现已被认为是结直肠癌早期筛查最有效的方式,新兴的内镜如染色内镜、放大内镜、超声内镜等明显提高了早期胃肠道肿瘤的检出率。在内镜技术迅猛发展的现在,内镜检查过程中能够对消化道黏膜病变进行实时、动态组织学预测成为了目前内镜发展的主要方向,而共聚焦内镜也应运而生。它是一种将微型共聚焦显微镜整合于传统内镜前端的新兴技术,通过点扫描激光分析,可在内镜检查的同时获取高分辨的黏膜表面和粘膜细胞形态学图像,可将扫描检查的组织放大1000倍,可对活体细胞和亚细胞结构进行观察,为体内组织学研究提供快速,可靠的诊断方法和诊断价值。BODIOY-FA(购买于life科技有限公司,货号：D3823,全称BODIPY(?)500/510C1,C12(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-DodecanoicAcid))其分子量为404,是荧光标记的长链脂肪酸类似物,具有亲脂性,其已被广泛应用于脂质转运的研究中,其激发／发射波长为500/510nm,能被488nm的氩离子激光器激活,可用于流式细胞仪及共聚焦显微镜下观察。在前期研究中,我们对95例肠癌组织及其对应正常组织的蛋白表达谱进行了汇总分析(取自于肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas)公开数据),根据分析数据绘制了相应代谢通路,我们发现,相较于正常细胞,癌细胞的代谢差异具体表现为：(1)癌细胞有氧糖酵解及胞内脂肪酸合成(其终产物为饱和脂肪酸)相关酶类大部分表达显著升高；(2)胞内脂肪酸利用(转化为胆固醇、磷脂、甘油三酯及非饱和脂肪酸类)相关酶类表达减少；(3)胞内脂肪酸氧化相关酶类表达减少；(4)细胞膜上脂肪酸相关转运蛋白表达减少；基于此,我们提出如下猜想：肿瘤的代谢网运用自身的可塑性,反馈循环以及相互作用以维持一个适宜的肿瘤环境,其中可塑性是其最重要的特性。有氧糖酵解及脂肪酸合成的增加以及胞内脂肪酸的转化和利用的减少,都将导致胞内脂肪酸(饱和脂肪酸)的蓄积,而胞内脂肪酸的蓄积将会导致产生脂毒性及活性氧类物质的增加,因此,肿瘤细胞通过增加NAPDH的生成以对抗应激及维持细胞生长,同时,脂肪酸合成增加可使胞内的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量增加以增加膜的密度,而细胞膜密度的增加也可阻碍外源性脂肪酸进入肿瘤细胞；此外,我们还发现了胞膜上的脂肪酸转运蛋白表达的降低,综上所述,是否代表肿瘤细胞可通过改变其脂肪酸转运蛋白的表达而使摄取外来脂肪酸呢?带着这样的疑问,我开始着手对课题的研究。研究目的探讨大肠肿瘤中脂肪酸吸收减少的现象和相关机制,并将共聚焦内镜作为载体,进一步拓展脂肪酸代谢的临床应用价值。研究方法1、Q-PCR, Western-Blot,免疫组化检测人肠道腺瘤组织,大肠癌组织与相应的正常组织脂肪酸转运蛋白表达差异(1)荧光定量PCR：提取组织总RNA并检测浓度,根据Takara PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time RNA逆转录试剂盒完成cDNA合成,使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq试剂盒和LC480 System荧光定量PCR扩增仪进行荧光定量PCR检测。(2) Western-Blot:提取组织蛋白,用BCA蛋白质定量试剂盒检测样品的蛋白浓度。经电泳、切胶,电转过程,蛋白质转至PVDF膜,5%BSA封闭,一抗孵育4℃过夜,一抗稀释比例分别为CD36(1:200)、FABP1(1:500)、Caveolin-1(1：500)、GAPDH (1:2000), TBST洗膜,而后二抗(1：2000)孵育1小时,按1：1比例配制Millipore Immobilon Western化学发光HRP底物试剂预混液化学发光法显影。(3)免疫组化：肠道增生性息肉(10例),低级别上皮内瘤变(10例),高级别上皮内瘤变(10例),以及结直肠癌手术患者配对标本(配对20例),组织经常规固定、包埋、切片、脱蜡、水化后,用0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)高压抗原修复3分钟,开盖自然冷却至室温,用Thermo scientific公司UltraVision Quanto Detection System HRP DAB二步法抗兔抗鼠通用性免疫组织化学检测试剂盒阻断、封闭,一抗稀释浓度为CD36(1：200)、FABP1(1:250)、 Caveolin-1(1：250),一抗孵育4℃冰箱过夜,然后DAB显色,苏木素复染、返蓝,常规脱水、透明及封片后,于显微镜下观察。2、流式细胞仪及共聚焦显微镜检测BODIPY-FA的吸收与定位(1)将细胞以相同密度5×106个/孔培养于用铝箔覆盖的十二孔板中,分别加入1ml含10% FBS的DMEM,温箱培养过夜。吸去培养基并用PBS清洗2次后,分别加入预温的1ml的2μmol BODIPY-FA混合液(溶于二甲亚砜(DMSO)保存,后根据所需浓度加入1 xPBS和0.1%牛血清蛋白(BSA)配成工作液),于恒温箱内放置3分钟,5分钟,10分钟,15分钟4个时间点,后吸去BODIPY-FA,PBS清洗并放入0℃冰上终止反应,经消化、离心后,流式细胞仪检测各时间点不同细胞对BODIPY-FA的荧光吸收值。(2)收集3例新鲜的肠癌组织及其对应的正常粘膜,将组织碎块放入培养皿中,置于冰上,反复洗涤,将组织碎块剪碎碾磨并放入离心管中,管内加入10ml溶于HBSS的50mg/ml IV型胶原酶,10 mg/ml链霉素E,2000U/ml脱氧核糖核酸酶及0.1mmol/L EDTA,37℃恒温箱并不断摇晃,后用100μm细胞过滤器去除未溶解组织碎片。然后用不含钙镁的HBSS溶液清洗细胞,1000rpm离心2-3min,重复2次。离心去上清,用HBSS重悬,过滤至新的无菌离心管中,加入等量的分离液,600g离心20min收集中间层,加入HBSS,重复上述清洗步骤,后加入预热的1ml的2μmol/LBODIPY-FA混合液,恒温箱内放置1分钟、5分钟、15分钟3个时间点,后续实验步骤同前。(3)将细胞铺种于激光共聚焦专用培养皿,加入1ml含10%胎牛血清(FBS)的高糖培养基(DMEM)中,放入含5%C02细胞培养箱中37℃培养24h。待细胞在细胞爬片上贴壁并且充分伸展开后,去除培养基,加入1ml PBS缓冲液清洗三次；后加入1ml 2μmol BODIPY-FA混合液孵育细胞15min(置于恒温箱中),PBS清洗细胞三遍,然后用1ml 4%多聚甲醛固定细胞30min,后滴加DAPI(1：20000)避光孵育15min,使细胞核染色。用Olympus激光共聚焦显微镜FV1000进行拍照。3、人离体组织的获取、成像及分类(1)人离体新鲜组织标本的收集来源于南方医院普外科及消化内科,病人筛选基于以下原则：①可获得病人完整的临床病理及随访资料；②病人术前无进食大量的高脂肪食物或服用脂类药物。此项研究获得南方医院医学伦理委员会批准(NFEC-2015-083)。(2)离体新鲜组织荧光显微镜成像：前期实验证实,小鼠离体大肠组织20分钟内仍可保持其吸收活性并呈现出良好的成像效果,为了尽量模拟在体成像,实验中将外科手术获取的新鲜的肠癌与正常交界部位组织立即放入37℃,5m1250μmol/L避光的BODIPY-FA混合液中浸染5min,后用预冷的生理盐水冲洗3遍并将其表面的水分擦干,将组织即刻包埋于OCT中,于干冰中速冻,后将组织置于冰冻切片机中(温度保持于-20℃)进行快速冰冻切片,厚度为4um,轮流贴片,同一部位对应两块玻片,其一行HE染色用于普通白光显微镜观察,经苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、梯度脱水后,用中性树胶封片；对应的另一块组织玻片用DAPI染核,PBST清洗风干后(避光),用抗荧光猝灭封片剂封片,然后再进行荧光显微镜观察。(3)离体新鲜组织共聚焦成像：将内镜切除的肠道组织标本及手术获取的新鲜肠癌组织与其对应的正常组织立即放入5m1250μmol/L的BODIPY-FA混合液中浸染15min,后用后用预冷的生理盐水冲洗以清除未结合的BODIPY-FA,成像过程由消化科内镜医师执行：即将共聚焦内镜的激光探头轻放置组织粘膜的表面,并由浅及深依层扫描,每个组织平均扫描时间为5min,扫描时共聚焦激光能量和亮度固定,以方便后续组织间灰度值的比较。获取扫描部位组织,经福尔马林固定24小时后,脱水,包埋,切片制作,脱蜡,水化,苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、梯度脱水,二甲苯透明后,用中性树胶封片,以进行HE染色获取组织学诊断的“金标准”。(4)共聚焦图像的分类：后期处理的实验结果过程中,将各个部位成像清晰的图片再次收集并根据拟定的分级标准交由另两位熟知共聚焦操作与成像的内镜医师评定。评定主要考虑3个组织病理学因素,第一为腺腔形态的异常,其有助于鉴别正常粘膜,增生粘膜以及瘤／癌变粘膜；其次为细胞核的异型性,其有助于细分低级别上皮内瘤变,高级别上皮内瘤变及癌的分级；最后可根据图片明暗的差异来区分正常部位与癌变部位。与此同时,运用静脉内注射荧光素钠的共聚焦图片也被纳入其中,评定标准同前。病理诊断由2位专业的病理医师根据Vienna分级评定。4、动物模型的构建与共聚焦成像AOM/DSS化学诱导结肠癌模型构建与成像：选取4-6周的Balb/c雄鼠,腹腔注射氧化偶氮甲烷(AOM)10mg/kg小鼠体重后,正常饮水1周。之后开始循环,即连续饮2.5% DSS混合液7天,再正常饮水14天,循环三次。预实验发现肠道发生癌变的小鼠便血严重,且癌变的肠段可出现肉眼可见的肠壁增厚、僵硬等变化。实验前,小鼠禁食12小时,后用戊巴比妥(0.01g/ml,剂量为6-7ul/g小鼠体重)腹腔注射麻醉,暴露腹腔,间断分离长约1cm的结肠,以手术缝线结扎肠段两端,结扎程度松紧适宜。用注射器吸取200u1250μmol/L的BODIPY-FA混合液注或500μmol/L 2-NBDG混合液或0.02%吖啶黄注射入结扎好的肠段内。10分钟后拆除缝线并冲洗,用棉签擦拭干净后,运用共聚焦内镜在体观察,观察方法同前所述。内镜观察结束后,实验者用29g注射器(吸取印度墨汁)准确标记经内镜医师判断过的病变部位并放入OCT中包埋制作组织冰冻切片,冰冻切片的处理方法同前人离体组织的处理。5、分析及统计方法及采用双盲法评价共聚焦内镜诊断结果平均灰度值与平均荧光强度使用Image J软件分析,图片选取的分析面积为100×100μm,同一病变选择10个区域并取其平均值,实验数据分析采用SPSSv13.0统计软件,两组间比较根据不同的统计标准运用t检验,单因素/双因素方差分析及非参数检验,取自肿瘤基因组学公开数据库的95例癌症与对应正常组织的蛋白表达水平差异分析运用Kolmogorov-Smirnov检验。共聚焦图片与荧光素钠图片诊断与HE诊断的一致性评价,.采用盲法,由两位内镜医师执行,所有的数据运用SAS 9.4软件分析。诊断一致性及评价者之间的一致性评价运用Kappa值(>0.6代表一致性良好),P<0.05具有统计学差异。结果1、FABP1、Caveolin-1和CD36在人结肠癌组织中表达降低根据蛋白组学分析数据,我们检测了一系列细胞膜脂肪酸转运相关蛋白(包括FABP1、Caveolin-1、CD36、FABPpm及FATP4),Q-PCR结果显示,与人正常的肠粘膜组织相比,肠癌组织中FABP1, Caveolin-1和CD36的mRNA表达水平分别下降了4.8倍,4.2倍,及20.9倍。同样,在蛋白表达水平上,,肠癌组织中FABP1, Caveolin-1和CD36的蛋白质水平相较于对应的正常肠粘膜分别下降了1.8倍,2.5倍和2.3倍。免疫组化实验实验结与Q-PCR及western-blot所观察到的现象一致,其中,CD36的表达在正常肠粘膜,低级别上皮内瘤变,高级别上皮内瘤变及癌组织中有明显的逐渐递减的趋势,故我们猜测这三种蛋白的表达减少一方面可阻止肠癌细胞吸收外源性的脂肪酸,另一方面则间接使肠癌细胞内脂肪酸合成增加。2、BODIPY-FA在大肠细胞内的吸收及定位大肠粘膜上皮正常细胞株(FHC)对BODIPY-FA的吸收相较于结肠癌细胞株(SW480, HCT116, LOVO)多(P<0.001)而且不同的肿瘤细胞间BODIPY-FA的吸收也存在差异,正常贴壁细胞吸收BODIPY-FA在15min内不断增加,而肿瘤细胞在15min时吸收趋缓。3对原代肠上皮细胞也表现了相同的吸收趋势。激光共聚焦显微镜结果证实BODIPY-FA沉积于细胞质与核周而不进入细胞核,且FHC相较于肠癌细胞胞质(SW480,LOVO)荧光强度更强,吸收BODIPY-FA更多。3、荧光显微镜与共聚焦内镜成像显示肠道肿瘤组织较对应的正常肠粘膜吸收BODIPY-FA减少我们对50个不同的正常与肿瘤交界部位的荧光图片进行了分析(来自20例组织标本),结果显示：90%的图片正常部位的平均荧光强度高于与其相邻的肿瘤部位(正常：0.07±0.004,肿瘤：0.04±0.003,p<0.0001)。共聚焦内镜成像过程中,我们发现所有的正常组织吸收的BODIPY-FA较癌组织明显增多,甚至将共聚焦内镜的激发光强度减弱一半,正常组织显像仍强于肿瘤组织。我们然后分别对在同一强度激发光下成像的非瘤变(149),低级别瘤变(103),高级别瘤变(132)与癌变(124)图像的灰度值进行了分析,发现了非瘤变部位的平均灰度值较低级别瘤变,高级别瘤变及癌变部位分别增强了1.6倍,2倍及2.2倍,虽然高级别瘤变图片与癌变图片之间平均灰度值无明显差异,证实了脂肪酸代谢的改变可能是肠道肿瘤发生过程中的早期事件。4、共聚焦内镜下BODIPY-FA的成像特点及诊断效能在共聚焦成像过程中我们发现,BODIPY-FA成像可显示正常粘膜腺体结构、细胞排列、细胞核规则排列于基底侧以及大量的杯状细胞；在增生性息肉中,腺体结构与细胞结构基本正常,可见星形的腺腔结构,杯状细胞数量正常或轻度减少；腺癌成像中,腺体结构极度扭曲或消失,同时伴“暗黑”的细胞核显著增大及排列紊乱。在低级别上皮内瘤变中,腺体结构轻微异常或延长,细胞核仍位于基底一侧,核／胞浆的比例基本正常,杯状细胞的数量略有减少,相反,在高级别上皮内瘤变中,细胞核极性消失,隐窝极度延长或出现背靠背或融合现象,核／胞浆的比例失调,杯状细胞的数量减少或消失,细胞连接也消失。如同另一种形式的HE染色特异、直观的展现观察部位的病变情况,而这也是其突出于其他染色剂的优势.据统计,评价者之间的诊断一致性良好(BODIPY-FA评价,κ=0.72,荧光素钠评价,κ=0.61)。BODIPY-FA共聚焦成像与HE之间诊断无显著差异性(χ2=3.29,p=0.6553)以及诊断一致性可达κ=0.68(p<0.001),虽然荧光素钠的诊断无显著差异(χ2=1.10,p=0.9540),但其诊断的一致性仅为κ=0.43(P<0.001)。5、激光共聚焦内镜下BODIPY-FA在活体小鼠肠癌模型中成像在离体组织,我们观察到脂肪酸吸收的差异,故进一步探讨了在活体肠癌模型小鼠肠道中BODIPY-FA的吸收情况,以及将其同其他局部作用的染色剂(2NBDG,盐酸丫啶黄(Acriflavine))的成像情况进行了对比。在13只AOM/DSS化学诱导的肠癌小鼠中,其中8只行BODIPY-FA染色,2只行2-NBDG染色,最后3只小鼠行盐酸吖啶黄染色。在AOM/DSS诱导的小鼠模型中,我们也观察到了随着小鼠肠道病变的恶化进展,BODIPY-FA吸收递减这一明显的趋势。在共聚焦内镜下,正常粘膜的平均灰度值相较于瘤变和癌变部位分别增强了2.5倍和1.7倍。此外,BODIPY-FA的染色在共聚焦内镜下能清晰的显示细胞形态,包括细胞排列的紊乱及细胞本身异型性的改变。而对比染色剂2-NBDG及盐酸丫啶黄(Acriflavine)在肿瘤与正常组织中未显现出强度差异,此外,2-NBDG局部染色显像模糊,荧光信号弱,而吖啶黄染色的部位,虽能显示胞核,但不同病变类型无差异。结论通过上述实验结果,我们得出以下结论：1、人结肠癌组织中FABP1、Caveolin-1和CD36的mRNA和蛋白表达显著降低,提示了肠道肿瘤对脂肪酸吸收减少可能与转运蛋白的表达下降有关。2、体内外实验均证实,随着大肠肿瘤的恶化发展,肠道对脂肪酸的吸收递减.3、BODIPY-FA是细胞质染色剂,对病变进行细胞、亚细胞水平的描述。其成像时间短,成像清晰,以及胞核显像等优点也许将使其作为共聚焦内镜的另一优选染色剂,特别是在早癌诊断的应用之中。4、 BODIPY-FA共聚焦内镜检查对病变的诊断效能好,本研究为临床实践及科研工作提供了发现早期肿瘤的新思路,具有重要的价值。