目的：　　 肾连接小管(Connecting tubule，CNT)是肾单位和集合管之间的过渡小管。在走行上，来自浅表皮质肾单位和近髓肾单位的连接小管与集合管的相接方式不同，走行的毗邻关系不同，并有种属差异。由于连接小管的上皮细胞成分由远曲小管和集合管上皮细胞成分以及它自身细胞成分组成，因此，连接小管兼具远曲小管和集合管的功能，同时又有连接小管细胞自身的重要功能，即微调Na、K、H等离子和水的重吸收。此外，免疫细胞化学技术显示，连接小管细胞上存在激肽释放酶，具有扩张血管的功能。此段小管虽然对钠、氢和水的转运不是最主要的节段，但是，对肾的重吸收的整体调节包括肾血循环和激素调节起重要的反馈作用。本研究借助计算机强大的图像处理和编程功能，对小鼠肾连接小管走行进行追踪，并在三维可视化的同时测量其长度。在此基础上，采用免疫组织化学方法，通过三维追踪的数据，对两种髓襻肾单位的连接小管的上皮转运体的分布进行研究，从而分析连接小管复杂细胞成分的分布。　　 实验方法：　　 1、树脂连续切片的标本制备　　 肾组织取自3只体重为25g的C57/BL/6J小鼠。腹主动脉灌流固定（1％戊二醛），同等缓冲液续固定过夜。垂直于肾长轴取组织块，锇酸后固定，梯度酒精丙酮脱水置换，树脂812包埋。采用超薄切片机进行半薄切片，从肾被膜到肾乳头，共得到2.5μm厚的连续切片2000张左右，甲苯胺蓝染色。　　 2、显微图像获取与配准　　 应用“计算机-显微镜-数码相机”图像采集系统，每隔一张切片进行拍照。图像大小为2596×1889像素，每个像素相当于1.16μm×1.16μm。图像配准引进丹麦奥胡斯大学细胞生物系Andreason教授自主研发的配准算法，在计算机Windows平台上进行操作。简言之，通过比较相邻两幅图像中生理对应点的像素灰度值的相似性，得出相邻两幅图的相对变换值（平移距离和旋转角度），计算相对变换值的相加函数，得出系列图像中每个图像的绝对变换值，从而实现图像配准。　　 3、数字追踪及三维分析　　 肾连接小管的追踪和长度测量是在计算机Linux平台上，通过C语言设计的系列程序实现的。肾小管走行的追踪始于肾小球尿极，终止于集合管在内髓的远侧端。本研究追踪了来自3个小鼠肾的38个肾单位，以及与之相连的6个集合管。通过对肾单位的全程追踪，确立连接小管来自于肾单位的种类。连接小管起始部的确立标志是肾单位远曲小管上皮结构特征的消失。　　 追踪过程自动生成一个数据文件，记录小管走行的空间坐标。基于此坐标集，连接小管走行的毗邻关系分析及长度测量得以实现。　　 4、连接小管膜转运体的免疫组织化学染色　　 在皮质深层至浅层，每隔20张连续切片选取一张切片，共计26个平面。树脂倒扣再包埋，半薄切片，进行连接小管3种细胞特异性膜转运体的免疫组织化学染色，即，水通道蛋白2（aquaporin2，AQP-2）、钠氯同转运体(Natrium chlorinumcotransporter，NCC)和质子ATP酶(H-ATPase)，分析连接小管不同水平的细胞组成。免疫组化的主要步骤为KOH甲醇溶液蚀刻树脂，甲醇与梯度乙醇水化切片，H2O2阻断内源性过氧化物酶；抗原修复，一抗孵育4℃过夜，PBS冲洗后二抗孵育；DAB显色；苏木素复染、脱水、透明、封片；光镜下观察（Nikon，80i，日本）。　　 实验结果：　　 1、连接小管的空间走行及长度　　 在皮质髓放线中，每条集合管在皮质浅层接收6～7个肾单位的连接小管。其中1或2条为长髓襻肾单位，其余为短髓襻肾单位。来自于长髓襻肾单位的连接小管起于位于皮质深层或中层的远曲小管末端，在中层和浅层皮质迷路内弓状上行，形成弓形管，途中有来自于浅表或中层皮质的短髓襻肾单位的连接小管加入。最终，弓形管在浅层皮质近被膜处返折，返折后不再有连接小管加入，并移行为集合管。来自于短髓襻肾单位的连接小管，除了在自身起源的肾小体附近的皮质迷路内上行，并与弓形管汇合，也有少数来自于最浅层皮质短髓襻肾单位的连接小管在近被膜下直接与集合管相连。但是，走行在被膜下的连接小管一般不直接接触被膜，其间隔常常是一条近端小管。几乎所有集合管从浅表皮质到髓质不再接收连接小管，在皮髓质交界处集合管开始与相邻集合管汇合。　　 来自于皮质不同平面的肾单位的CNT走行长度因向上走行的距离差异很大，很难用平均值来表示，尤其是来自于深层皮质肾单位的CNT和弓形管。来自于浅表和中层皮质短髓袢的CNT长度范围为150～500μm，而来自于深层或中层皮质长髓袢的CNT上升形成的弓形管长度范围为700～1200μm。　　 2、细胞成分分析　　 根据免疫组织化学染色和细胞形态学特征，连接小管由四种细胞成分组成：远曲小管细胞、主细胞和闰细胞（集合管上皮细胞），以及连接小管自身特征细胞，即连接小管细胞。树脂切片免疫组化结果显示，无论长髓襻还是短髓襻，连接小管细胞分布于小管全程，远曲小管细胞只出现在连接小管的起始段；闰细胞出现较早并分布在连接小管的全长；主细胞在长髓襻肾单位连接小管出现较晚，主要分布在连接小管近集合管处。主细胞在短髓襻肾单位的连接小管出现较早。　　 结论：　　 1、肾单位只在皮质浅层或经CNT，或经弓形管汇入集合管系，集合管在穿过中层和深层皮质时不再有新的肾单位加入，提示集合管从皮质浅层接收肾单位输送的滤过液后，在整个下行过程中不再接受其它肾单位的滤液，滤液离子浓度稳定，重吸收功能不受其它肾单位影响。　　 2、连接小管4种细胞成分分布呈一定的规律性。由于连接小管细胞和远曲小管细胞都有重吸收Na的功能，因而，连接小管对Na的调节明显；而对水的重吸收功能主要在连接小管的后半段进行。