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目前,越来越多的基因被发现参与了电离辐射损伤,同时也发现电离辐射损伤可以引起机体一些细胞因子、酶类和基因表达的改变,而一些分子的改变与机体的损伤程度和辐射剂量相关。研究基因在电离辐射损伤中的作用,针对这些基因的特性,运用生物学手段改变机体对电离辐射的效应成为放射医学领域研究的热点之一HMGB1是一种存在于真核生物细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白,目前被认为是一种危险相关分子模式分子,在细胞的生存和死亡过程中发挥了重要的调节作用。本课题研究了细胞和机体接受电离辐射后HMGB1的变化,HMGB1在电离辐射损伤中的作用及其相关机制,以及通过RNAi抑制HMGB1的表达对细胞辐射敏感性的影响及机制。旨在寻找新的放射损伤生物标志物和深入探讨电离辐射损伤机理,为进一步拓展电离辐射在医学和生命科学中的应用范围和辐射防护损伤救治提供实验依据。本课题实验共分三个部分。第一部分电离辐射诱导HMGB1的转位和释放研究了电离辐射诱导细胞HMGB1的转位和释放,以及释放的HMGB1的剂量和时间效应,为后续研究HMGB1在电离辐射损伤中的作用和机制奠定基础。采用免疫荧光和Western blot观察GM细胞和16HBE细胞受到8Gy 6MV-X射线照射后24h细胞核和细胞浆中HMGB1的表达情况。用Western blot检测12种细胞受到不同电离辐射后24h培养液中HMGB1的变化情况,以及细胞接受6Gy照射后不同时间HMGB1的变化情况。采用ELISA监测在体动物受到电离辐射后外周血HMGB1对照射剂量和照后时间的变化情况,最后对正常人体和接受放疗的肿瘤患者血清中HMGB1的含量进行了初步分析。结果显示:(1)当接受8Gy 6MV-X射线照射后24h,GM细胞和16HBE细胞核内HMGB1向胞浆转移。12种细胞在没有电离辐射时细胞培养液中几乎没有或者有很少量的HMGB1蛋白,随着剂量的增加,培养液中HMGB1含量也逐渐升高,呈剂量依赖性;细胞在接受6Gy 6MV-X射线照射后细胞培养液中HMGB1含量随观察时间的延长而增加,具有时间累积效应。(2)SD大鼠在没有接受电离辐射时外周血HMGB1的含量很低,约4.34μg/L,在接受不同剂量全身照射后24h,大鼠外周血HMGB1含量随剂量的升高而增加。SD大鼠接受6Gy 6MV-X射线全身照射后2h,外周血HMGB1含量开始升高,在24h左右达到高峰,约14.1μg/L,之后又有所下降,至照射后7d仍然高于照射前水平。(3)正常人外周血中HMGB1的含量为5.31±0.42μg/L,肿瘤患者放疗前外周血HMGB1的含量平均为5.78±1.41μg/L,照射30Gy时为5.76±1.38μg/L,照射50Gy时5.96±1.91μg/L,各组数值之间无统计学意义。第二部分细胞外HMGB1在电离辐射损伤中的作用及其信号通路研究研究了细胞外HMGB1是否参与了电离辐射损伤?并对相关机制进行了初步探讨。收集GM细胞和16HBE细胞接受8GyX射线照射24h后的培养基,即电离辐射条件培养基(ICM),采用这种培养基分别培养未照射的GM细胞和16HBE细胞,以观察细胞的存活率和DNA双链断裂情况,了解照射导致释放至细胞外的HMGB1对细胞的损伤情况。同时,加入抗HMGB1抗体中和条件培养基中的HMGB1进行干预,观察细胞的存活率和DNA双链断裂情况。用HMGB1的阻断剂丙酮酸乙酯(EP)处理细胞和小鼠,观察电离辐射对细胞和小鼠的损伤情况。采用免疫共沉淀技术研究HMGB1和受体蛋白RAGE的结合情况,Western blot检测HMGB1发挥电离辐射损伤因子的细胞内相关通路上磷酸化的ERK和JNK蛋白表达情况。结果显示:(1)MTT检测细胞存活率表明:GM细胞和16HBE细胞接受4Gy照射后细胞存活率均下降,当照射后即刻加入抗HMGB1抗体,其存活率回升,P<0.05。未照射的GM细胞和16HBE细胞在采用ICM培养后其细胞存活率亦出现下降,当ICM中加入抗HMGB1抗体后,未照射的GM细胞和16HBE细胞的存活率提高,P<0.05。(2)免疫荧光实验结果表明,当照射后即刻加入抗HMGB1抗体后,可以减少GM细胞和16HBE细胞在接受4Gy照射后细胞核中γ-H2AX foci的数量。当向细胞ICM中加入抗HMGB1抗体后可以减少GM细胞和16HBE细胞核中γ-H2AX foci的数量,P<0.05。(3)EP阻断GM细胞和16HBE细胞接受4Gy照射后24h向细胞外释放HMGB1,当照射前24h加入EP(终浓度为10μm/L)后可以逆转GM细胞和16HBE细胞在接受4Gy照射后的细胞存活率。当照射前24h加入EP后可以减轻GM细胞和16HBE细胞在接受4Gy照射后细胞核中γ-H2AX foci的数量,P<0.05。(4)EP延长小鼠电离辐射后的生存时间结果表明,与12 Gy X-射线照射+生理盐水组相比,照射前及照射后分别多次经腹腔注射EP(总剂量为40mg/kg)的C57小鼠,其平均存活时间显著增加(?)(P<0.05)。(5)Westernblot分析电离辐射诱导RAGE的表达发现,GM细胞和16HBE细胞在接受4Gy照射后24h细胞中RAGE的表达较对照组(0Gy)明显升高,P<0.05。(6)IP结果显示HMGB1存在于RAGE的IP复合蛋白中,而RAGE蛋白也存在HMGB1的IP复合蛋白中。(7) Western blot分析细胞内相关信号通路蛋白显示:GM细胞和16HBE细胞在接受4Gy照射和条件培养基后24h,细胞中磷酸化的ERK和JNK蛋白呈高表达;在条件培养基中加入抗HMGB1抗体和抗RAGE抗体后24h,细胞中照射导致的磷酸化的ERK和JNK表达受到抑制。第三部分RNAi降低HMGB1的表达对细胞辐射敏感性的影响及机制研究通过RNAi降低HMGB1的表达,研究HMGB1对细胞辐射敏感性的影响,并对其机制进行了初步探讨,研究核内HMGB1在电离辐射损伤中的作用和机制。采用HNGB1 siRNA降低GM细胞和16HBE细胞中HMGB1,并用RT-PCR和Western blot检测细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的抑制情况。MTT法测定细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期的改变,克隆形成实验检测细胞的细胞存活以及辐射敏感性,免疫荧光检测γ-H2AX foci, Western blot分析细胞中与辐射损伤相关蛋白Ku-70、FEN-1和XRCC1蛋白的表达和信号通路相关蛋白NF-κB蛋白、DNA-PKC蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表达。结果显示:(1)采用HMGB1 siRNA和脂质体转染方法获得成功降低HMGB1表达的GM细胞和16HBE细胞。(2)降低HMGB1后的GM细胞和16HBE细胞的形态并没有发生明显的变化,细胞周期以S细胞比例较多。(3)克隆形成实验发现,HMGB1 siRNA降低HMGB1的表达可以提高GM细胞和16HBE细胞的辐射抗性,降低细胞核内γ-H2AX foci的数量。(4) Western blot分析HMGB1 siRNA降低HMGB1的表达后,GM细胞和16HBE细胞中与辐射损伤相关蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白呈高表达,信号通路相关蛋白NF-κB蛋白、DNA-PKC蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表达也表现为升高,在受到照射后升高更为明显。结论:1.电离辐射可以诱导细胞内HMGB1从核内向胞浆中移位,并导致HMGB1向细胞外释放,而且释放HMGB1的量具有时间和照射剂量依赖性。2.SD大鼠接受全身照射后,外周血HMGB1含量升高,同样具有剂量依赖性。大鼠在接受6Gy的6MV-X射线照射后2h,血清中的HMGB1蛋白水平即可见升高,并一直持续到照后7d,血清中仍然可以测定到较高的HMGB1水平。接受放疗的肿瘤患者血清中HMGB1的变化则比较复杂,需扩大样本继续研究。3.细胞外HMGB1参与了细胞的电离辐射损伤,EP可以阻止细胞HMGB1的释放,减轻电离辐射对细胞的损伤。其具体机制可能是细胞外的HMGB1与细胞膜上的RAGE受体结合,激活了MAPK通路,进而参与了细胞损伤。4.HMGB1 siRNA可以降低GM细胞和16HBE细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表达。降低细胞内HMGB1的表达可以抑制细胞生长,提高GM细胞和16HBE细胞的辐射抗性,并出现S期细胞周期阻滞,同时降低了DNA双链断裂程度。5.下调HMGB1增加细胞辐射抗性的机制,可能与提高GM细胞和16HBE细胞中辐射损伤相关蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白的表达,以及激活了NF-κB和AKT信号通路,使NF-κB蛋白、DNA-PKC蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表达升高有密切的关系。