一直以来,豆科植物如何在结瘤过程中维持平衡状态都是一个很重要的研究课题。目前研究报道,豆科植物结瘤的自调节机制（AON）能够通过地上部分和地下部分之间的信号传递以维持结瘤数目的平衡。除了这种长距离的自调节之外,人们推测在植株地下部分也存在一个未知机制来调节并维持结瘤的平衡,然而目前还没有报道。MtDM2（与百脉根LjSymRK是同源蛋白）是亮氨酸重复（LRR）的类受体激酶（LRR-RLK）,处于MtDMI2-MtDMII-MtDMI3结瘤信号途径的上游,作为一个重要的信号传递者,一旦将结瘤信号传递下去就无法逆转,所以植物体是以何种工作机制在翻译后水平上调控MtDMI2的,这是一个重要的科学问题。目前已经有一些关于MtDMI2/Lj SymRK互作蛋白的报道:例如MtHMGR1,编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶;以及一个Plant U-box（PUB）类的E3泛素连接酶——MtPUB1,能够与MtDMI2互作。虽然以上报道揭示了一些与MtDMI2/Lj SymRK互作的蛋白以及其相应的功能,但迄今还没有具体阐释结瘤类受体激酶在结瘤信号传递途径中是如何被严谨调控的。本研究结果表明,在截形苜蓿结瘤过程中,存在一个MtDMI2-MtPUB2的负反馈环,这个负反馈环能够在维持结瘤平衡中起到重要作用。本研究首次发现了一个新的PUB类E3泛素连接酶,命名为MtPUB2。结果表明,MtPUB2能够在体外和体内以多聚泛素化的方式介导MtDMI2通过26S蛋白酶体途径发生降解。并且MtDMI2能够通过MtPUB2的第421位丝氨酸磷酸化修饰MtPUB2。更加重要的是MtPUB2泛素化MtDMI2是依赖于后者对其的磷酸化修饰。由于没有在截形苜蓿Tilling突变体库和Tnt1突变体库中筛选到MtPUB2基因的突变体,为了研究MtPUB2的生物学功能,分别应用发根农杆菌介导的毛根转化法和根癌农杆菌介导的叶盘转化法得到了MtPUB2-RNAi植物材料。接种根瘤菌的结瘤表型实验结果表明,MtPUB2-RNAi的植株与野生型植株相比,表现出侵染线数目减少,根瘤数目减少,根长变短以及根瘤密度下降的表型。同时还发现MtPUB2是一个多功能蛋白,参与了植物生长、开花时间调控以及抗病信号途径。而且一旦MtPUB2基因的干扰效率达到0.95,植株则会出现延滞生长、不育直至死亡的现象。进一步对MtPUB2和MtDMI2的互作与结瘤的关系进行验证,采用定量Western blotting实验方法对野生型截形苜蓿A17生态型和突变体截形苜蓿dmi2-1（TR25）进行研究,分别在同时期接种根瘤菌S.meliloti 1021和水对照,在接种后的不同时间点取根部样本（0h,5h,12h,24h,3 DAI,5 DAI,7 DAI,14 DAI,21 DAI 和 28 DAI;hours,h;days after inoculation,DAI）并提取总蛋白进行定量Western blotting分析。实验结果表明,随着MtDMI2蛋白量的增加,MtPUB2也随之增加;反之,MtDMI2下降,MtPUB2也随之下降,两者的变化关系随着时间的延长呈现出波峰波谷起伏的曲线形态。采用数学建模的方法,即运用Lotka-Volterra方程（LV equations）在matlab程序中对MtDMI2和MtPUB2的变化关系进行深入探讨。结果表明,MtDMI2和MtPUB2在接种根瘤菌后24 h至21 DAI之间,呈现出一种Prey（MtDMI2）-Predator（MtPUB2）的关系,符合负反馈环的工作模型。综上所述,在本研究中提出MtDMI2和MtPUB2的一个工作模型:当截形苜蓿的根部接收到来自根瘤菌分泌的结瘤因子（NF）信号之后,会通过MtNFP和MtLYK3一级结瘤（类）受体激酶传递到MtDMI2,MtDMI2继续向下游传递信号,此时MtDMI2通过Ser421位点磷酸化MtPUB2进而激活MtPUB2,MtPUB2被激活后,能够发挥其E3泛素连接酶功能,从而对MtDMI2进行多聚泛素化修饰,最终介导MtDMI2通过26S蛋白酶体途径发生降解,因此维持了结瘤过程的动态平衡。但是这种平衡一旦被破坏,就会出现侵染线数目减少,根瘤数目减少以及根瘤发育不正常的表型。与癌症研究中的p53-MDM2工作模型类似,p53是一个肿瘤抑制因子,MDM2是一个E3泛素连接酶,能够多聚泛素化降解p53。在正常的健康细胞中,p53-MDM2的负反馈环需要维持一种平衡状态。而如何在豆科模式植物截形苜蓿MtDMI2-MtDMII-MtDMI3的结瘤信号途径中维持一种平衡状态,一直以来都未见报道。所以,本研究揭示了截形苜蓿中一个结瘤类受体激酶和E3泛素连接酶之间的新工作机制,并且这个工作机制在控制豆科植物结瘤平衡中扮演重要的角色,是解释豆科植物如何保持结瘤平衡状态这个科学问题的又一突破。