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目的本课题以体外乏氧培养bEnd.3细胞以及在体植骨压迫联合力学失衡模拟椎动脉型颈椎病(CSA)缺血缺氧状态,观察血管内皮细胞在乏氧缺血状态下自噬的变化以及活血定眩胶囊(Huo-Xue-Ding-Xuan-Capsule,HXDXC)的干预作用,为HXDXC临床的进一步应用提供实验依据。方法1.体外培养bEnd.3细胞,随机分7组:正常对照组、模型组、10%HXDXC含药血清组、LY294002组、雷帕霉素组、LY294002+10%HXDXC含药血清组、雷帕霉素+10%HXDXC含药血清组,除正常对照组外其它组乏氧培养建立氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)模型,分别应用PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂LY294002和雷帕霉素以及10%浓度HXDXC含药血清进行干预,后通过透射电镜观察各组bEnd.3细胞自噬体;Ad-mCherry-GFP-LC3B重组腺病毒转染激光共聚焦下观察LC3B表达;Western blot技术检测各组bEnd.3细胞LC3Ⅱ、Beclin1、P62等蛋白表达及加入抑制剂LY294002和雷帕霉素后p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的表达情况。qRT-PCR技术检测各组bEnd.3细胞Beclin1、ATG5、PI3K、Akt、mTORmRNA相对表达量。通过上述实验观察10%浓度HXDXC含药血清对bEnd.3细胞自噬的影响。2.将80只Wistar雄性大鼠随机分为8组,每组10只,具体分组为:正常对照组、假手术组、模型组、HXDXC高(1.26g/kg)、中(0.63g/kg)、低(0.315g/kg)剂量组、氟桂利嗪组(1.05mg/kg)、颈复康组(1.05g/kg),除正常对照组、假手术组外,其他组均采用植骨压迫联合力学失衡法建立CSA大鼠模型。造模成功后,连续喂养6周,后动物麻醉,心脏釆血,颈椎脱臼处死,取出椎动脉。大鼠处死前,在不同时间段测量大鼠的体重及单日饮水量,并运用Morris水迷宫实验观察大鼠的反应及空间识别能力;ELISA法检测各组大鼠血清中一氧化氮(NO)浓度、血管内皮素(ET-1)含量与超氧化物歧化酶(SOD)的活性;透射电镜观察椎动脉血管内皮自噬体;免疫组化检测椎动脉血管内皮组织P65、Beclin1、LC3B蛋白表达;免疫荧光方法计数椎动脉血管内皮细胞组织LC3的点状聚集;Western blot方法检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平;qRT-PCR方法检测法检测自噬相关基因ATG5、Beclin1、LC3 mRNA的表达。通过上述实验,观察不同剂量HXDXC对CSA模型大鼠椎动脉血管内皮细胞自噬的调节作用,明确干预自噬最佳剂量的HXDXC组。3.在实验二的基础上筛选出最佳剂量的HXDXC剂量组,采用植骨压迫联合力学失衡法建立CSA大鼠模型,造模成功后,随机分5组,分别用PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂雷帕霉素以及最佳剂量组的HXDXC进行干预,具体分组为:模型组、LY294002组、雷帕霉素组、LY294002+HXDXC最佳剂量组、雷帕霉素+HXDXC最佳剂量组。连续喂养6周,后动物麻醉,心脏釆血,颈椎脱臼处死,取出椎动脉,采用透射电镜观察椎动脉血管内皮细胞自噬体,免疫荧光方法计数椎动脉血管内皮细胞LC3的点状聚集;Western blot方法检测自噬相关基因Beclin1、LC3Ⅱ、P62以及p-P13K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平;qRT-PCR方法检测自噬相关基因ATG5、Beclin1、LC3mRNA以及PI3K、Akt、mTORmRNA的相对表达量。结果:1.bEnd.3细胞乏氧培养6h后,经PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂雷帕霉素和10%HXDXC含药血清干预,结果显示:透射电镜下,可见模型组、10%HXDXC含药血清组与雷帕霉素组细胞内有大量空泡双层膜结构,里面包绕着自噬体,而LY294002组与正常对照组较少;Ad-mCherry-GFP-LC3B重组腺病毒转染后,激光共聚焦下发现模型组、10%HXDXC含药血清组和雷帕霉素组有大量黄色斑点,而LY294002组黄色斑点较少,其中雷帕霉素+10%HXDXC含药血清组较雷帕霉素组少;Western blot检测结果显示:与正常对照组比较,模型组、10%HXDXC含药血清组、雷帕霉素组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达升高,P62表达降低(P<0.05);与模型组比较,LY294002组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt表达降低,P62表达量升高(P<0.05),雷帕霉素组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达升高,p-mTOR/mTOR、P-Akt/Ak、P62表达降低(P<0.05);LY294002+10%HXDXC含药血清组与LY294002组比较LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K的表达增高(P<0.05);雷帕霉素+10%HXDXC含药血清组与雷帕霉素组比较LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达减少,P62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达量增加(P<0.05);qRT-PCR检测结果显示:与模型组比较,LY294002组Beclin1、ATG5、PI3KmRNA表达降低(P<0.05),雷帕霉素组Beclin1、ATG5表达升高,mTORmRNA表达量低(P<0.05);LY294002+10%HXDXC含药血清组与LY29002组比较Beclin1、ATG5、PI3KmRNA的表达量增加(P<0.05);雷帕霉素组+10%HXDXC含药血清组与雷帕霉素组比较Beclin1、ATG5mRNA表达降低,mTORmRNA表达升高(P<0.05)。2.动物在体实验,观察不同剂量HXDXC对CSA大鼠的影响,结果显示:HXDXC能改善CSA大鼠生理状况并提高记忆及空间识别能力;造模后大鼠血清中NO浓度、SOD活性均降低,ET-1含量均升高;经药物干预后,HXDXC高剂量组、氟桂利嗪组、颈复康组NO浓度、SOD活性均升高,ET-1含量均降低,说明大鼠经植骨压迫联合力学失衡造模后血管受损收缩,氧化活性降低,而HXDXC能明显调节血管收缩因子及氧化活性物质。透射电镜检测结果显示:模型组椎动脉血管内皮细胞可见大量自噬体,而HXDXC高剂量组自噬体明显减少;免疫荧光激光共聚焦检测发现模型组有大量的LC3聚集点,而HXDXC高剂量组的LC3聚集点减少,荧光灰度值分析有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示:与正常对照组比较,模型组椎动脉组织中P65、Beclin1和LC3B表达较高(P<0.05);与模型组比较,HXDXC高剂量组P65、Beclin1和LC3B表达降低(P<0.05),与颈复康组、氟桂利嗪组比较无显著差异(P<0.05);Western blot检测结果显示:与正常对照组比较,模型组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量均升高,P62表达量下降(P<0.05);与模型组比较,HXDXC高剂量组、氟桂利嗪组、颈复康组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量减少,P62表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR结果显示:与正常对照组比较,模型组ATG5、Beclin-1、LC3mRNA的表达量升高(P<0.05);与模型组比较,HXDXC高剂量组、氟桂利嗪组、颈复康组ATG5、Beclin1、LC3mRNA表达量均下降(P<0.05)。3.植骨压迫联合力学失衡法建立CSA动物模型,采用PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂雷帕霉素和HXDXC高剂量干预后。实验结果显示:透射电镜下发现模型组与雷帕霉素组椎动脉血管内皮细胞有大量自噬体,而LY294002组较少。免疫荧光检测LC3点状聚集数目,发现模型组与雷帕霉素组有大量聚集点,而LY294002组较少(P<0.05);LY294002+HXDXC高剂量组与LY294002组比较,LC3点状聚集数目增多,雷帕霉素+HXDXC高剂量组与雷帕霉素组比较,LC3点状聚集数目减少,荧光灰度值分析,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示:与模型组比较,LY294002组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达降低,P62表达量升高(P<0.05),雷帕霉素组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达升高,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达降低(P<0.05);LY294002+HXDXC高剂量组与LY29002组比较LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K的表达量升高,雷帕霉素+HXDXC高剂量组与雷帕霉素组比较LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达降低,P62、p-mTOR/mTOR表达量升高(P<0.05)。qRT-PCR结果显示:与模型组比较,LY294002组Beclin1、LC3、ATG5、PI3KmRNA表达降低,雷帕霉素组Beclin1、LC3、ATG5mRNA表达升高,mTORmRNA表达降低;LY294002+HXDXC高剂量组与LY29002组比较Beclin1、LC3、ATG5、PI3KmRNA的表达量升高(P<0.05);雷帕霉素+HXDXC高剂量组与雷帕霉素组比较Beclin1、LC3、ATG5mRNA表达减少,mTORmRNA表达增加(P<0.05)。结论:1.体外乏氧培养小鼠脑微血管内皮bEnd.3细胞6h后,可激活自噬。经PI3K抑制剂LY294002干预后,自噬程度减弱;经mTOR抑制剂雷帕霉素干预后,自噬程度增强。而10%HXDXC含药血清对经LY294002抑制剂干预后bEnd.3细胞自噬具有促进作用,对雷帕霉素干预后bEnd.3细胞自噬具有抑制作用。说明PI3K/Akt/mTOR信号通路在组织缺血缺氧后调节自噬的发生发展中起着关键作用,10%HXDXC含药血清对bEnd.3细胞自噬起双向调节作用。2.植骨压迫联合力学失衡法建立CSA动物模型后,大鼠椎动脉血管内皮细胞发生自噬现象。但经药物干预后,自噬受到了不同程度的抑制,血管内皮细胞的活性较模型组有很大改善,其中高剂量的HXDXC效果更佳,说明血管在受到压迫缺血缺氧后,血管内皮受到损伤,并发生自噬现象,而HXDXC可能通过抑制CSA大鼠椎动脉血管内皮细胞自噬来调节血管内皮功能。3.CSA模型大鼠经PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂雷帕霉素干预后,椎动脉血管内皮细胞自噬受到了不同程度的抑制或激活,而经高剂量的HXDXC干预后,椎动脉血管内皮细胞自噬表现为在自噬缺乏时HXDXC能够增加自噬强度,当自噬过渡时,又起到适当抑制的作用。HXDXC这种调节自噬的功能,可能是其保护血管内皮细胞功能其中的机制之一。