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降钙素原(procalcitonin,PCT)是目前公认的炎性标志物,在感染性疾病的鉴别诊断、疗效监测和预后判断等方面有重要价值。免疫荧光和电化学技术的联合应用实现了对PCT的定量、快速检测。目前PCT的检测试剂盒均基于抗原抗体的特异性结合反应,其抗原和抗体均来源于进口厂商。制备稳定的抗原和高特异性的单克隆抗体是实现国产化产品的基础。目的:原核表达人降钙素原重组蛋白,优化蛋白表达条件;制备高纯度的PCT单克隆抗体并对其进行鉴定;建立PCT荧光免疫层析方法,对临床标本进行检测以评估性能。方法:将构建的重组表达菌株E.coli BL21(含PCT-pET22b(+))活化,诱导表达PCT蛋白,优化IPTG诱导蛋白表达的浓度。用Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化,蛋白印迹法和胶体金法对其进行鉴定。获得的PCT重组蛋白与佐剂充分研磨乳化,采用长程免疫法皮下多点注射Balb/c小鼠,4次免疫后检测小鼠血清抗体效价。达到融合条件后,取脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并进行亚克隆3~4次。将单克隆细胞株注入小鼠腹腔刺激产生腹水,利用辛酸硫酸铵法和Protein G亲和层析法对腹水中抗体进行纯化,并对其进行纯度、亚型、效价、亲和力等鉴定。对制备的单克隆抗体进行荧光胶乳标记,通过荧光值检测及间接ELISA法判断标记后抗体活性。分析抗体配对结果,建立荧光胶乳免疫层析方法,优化捕获抗体和标记抗体工作浓度,对临床标本中的PCT含量进行检测。结果:重组表达菌株经超声裂解后,取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,结果显示在相对分子质量约14kDa处有一明显的条带,与目的蛋白大小相符,且主要存在于上清中,说明该目的蛋白为可溶性蛋白。对诱导剂IPTG浓度进行优化,结果显示当IPTG终浓度为0.8mmol/L时蛋白表达量达到最高。利用Ni-NTA层析法对上清中的蛋白进行纯化,SDS-PAGE结果可见目的蛋白纯度较高能满足动物免疫的要求。蛋白印迹法和胶体金法证明该可溶性蛋白为PCT,并且含his-标签。纯化后的PCT作为免疫原免疫Balb/c小鼠,3只鼠经4次免疫后血清抗体效价分别达10~6,10~6,10~5,满足细胞融合条件。取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合,通过间接ELISA法成功筛选出7株阳性杂交瘤细胞(B3,C4,C7,E9,F8,F10,G2),选择其中2株(B3和C4)继续培养。通过体内诱生法分别将细胞株注入小鼠腹腔刺激产生单克隆抗体,经辛酸硫酸铵法和Protein G亲和层析法纯化后SDS-PAGE电泳显示在25kDa和55kDa处各有一明显条带,为免疫球蛋白的轻链和重链,纯度可达95%以上,亚类鉴定均为IgG1型。间接ELISA法检测B3、C4腹水抗体效价分别为10~8、10~7,纯化后抗体效价可达10~7,亲和常数分别为5.06×10~8,7.3×10~8。荧光胶乳标记后抗体的荧光值可达25万左右,间接ELISA法结果示抗体稀释10~5后OD450在1.5以上,说明标记后抗体仍然具有良好的活性。B3-C4抗体配对成功,对抗体工作浓度进行优化,包被抗体浓度为1.5mg/ml,胶乳标记抗体浓度为400μg/ml,喷膜最佳稀释比例为1:10。与免疫化学发光法相比,两批临床样本检测结果的相关系数分别为0.9871,0.9984。结论:通过对诱导条件的优化,获得了高纯度的PCT重组蛋白;利用细胞融合技术成功获得PCT单克隆抗体;初步建立了荧光免疫层析检测方法,具有良好的检测性能。