论文部分内容阅读
目的：本实验通过观察重组p53腺病毒（recombinant human adenovirus p53，rAd-p53）对不同p53基因型的肝癌细胞生长及放射敏感性的影响，为rAd-p53联合放疗治疗原发性肝癌提供依据。方法：（1）将人肝癌细胞HepG2（p53野生型）和人肝癌细胞PLC/PRF/5（p53突变型）接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2传代培养。（2）采用四甲基偶氮唑蓝比色试验法（MTT法）检测rAd-p53对两种肝癌细胞增殖的抑制作用，用Ad-EGFP（含加强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescentprotein，EGFP）报告基因的腺病毒，构建方式及载体的结构与rAd-p53完全相同，但不含p53基因）做对照。（3）取不同病毒滴度的Ad-EGFP感染两种肝癌细胞，于荧光倒置显微镜下观察两种肝癌细胞EGFP表达。（4）采用western blot法检测rAd-p53转染肝癌细胞后p53蛋白的表达情况。（5）集落形成法观察rAd-p53对两种肝癌细胞的放射增敏作用。（6）将两种细胞各分为空白组，单纯放射组，Ad-EGFP组，rAd-p53组， Ad-EGFP+放射组，rAd-p53+放射组，流式细胞仪检测细胞凋亡。（7）数据采用SPSS13.0统计软件处理，实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组之间比较采用两组独立样本t检验，p<0.05为有统计学意义。结果：（1）MTT法结果显示随着病毒滴度或感染时间的增加，生长抑制效应亦逐渐增强，15MOI rAd-p53感染48h，人肝癌细胞HepG2、PLC/PRF/5生长抑制率分别为（7.30±1.78）%和（11.51±1.53）%（p<0.01），此病毒滴度及作用时间对细胞毒害小，可用作后续实验。（2）随着病毒滴度或感染时间的增加，两种肝癌细胞发出绿色荧光的细胞数量及发光强度均逐渐升高，15MOI Ad-EGFP感染人肝癌细胞48h，约有85%细胞发出强弱不等荧光。（3）western blot法检测15MOIrAd-p53感染两种肝癌细胞后24h，p53蛋白表达均有增加，当感染后第72h表达量达到最大，96h表达量下降。（4）根据集落形成法实验结果绘制的存活曲线及相关参数显示，rAd-p53对人肝癌细胞HepG2、PLC/PRF/5均有放射增敏作用，联合组的平均致死剂量（D0）及准阈剂量（Dq）均小于单纯照射组，放射增敏比（SER）分别为1.24和1.52。（5）细胞凋亡分析结果显示，rAd-p53+放射组中人肝癌细胞HepG2、PLC/PRF/5细胞凋亡率分别为（22.19±1.04）%和（30.36±2.74）%（p<0.01）；均明显高于空白组和Ad-EGFP组。结论：rAd-p53能够介导野生型p53基因转染肝癌细胞并持续高效的表达p53蛋白，能显著抑制人肝癌细胞生长、诱导细胞凋亡及提高细胞放射敏感性，并且对PLC/PRF/5细胞（p53突变型）作用强于HepG2（p53野生型），提示外源性野生型p53基因对不同p53功能状态的肝癌细胞生长、凋亡及放射敏感影响是不完全相同的。