目的紫杉醇作为一线化疗药物被广泛应用于多种类型癌症的治疗。但最新的研究表明,持续的紫杉醇治疗,有可能会导致肿瘤的扩散和外渗。Micro RNAs在促进肿瘤形成和转移的过程中发挥重要作用。本课题组前期运用mi R-21反义寡核苷酸联合低剂量紫杉醇可有效提高药物的治疗效果。本研究主要探讨紫杉醇诱导肿瘤转移的分子机制,以及运用mi R-21小分子抑制剂--AC1MMYR2联合紫杉醇对提高化疗药效和细胞转移的影响和相关的分子机制。方法1.根据TCGA数据库,分析正常组织和肿瘤组织中mi R-21和CDK5的表达水平。利用原位杂交和免疫组化分别检测58对有无淋巴转移的乳腺癌组织中mi R-21和CDK5的表达水平,研究mi R-21和CDK5的表达模式与肿瘤转移之间的关系。2.采用乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人脑胶质母细胞瘤细胞系U87VIII,实验分别设置为细胞对照组(control组)、低剂量紫杉醇组(0.5μM)和高剂量紫杉醇组(2μM)。Western blot检测各组中E-cadherin、β-catenin、vimentin和CDK5的表达情况。Real-time PCR检测各组中mi R-21的表达水平。3.采用乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人脑胶质母细胞瘤细胞系U87VIII,实验分别设为control组、紫杉醇组、AC1MMYR2组和紫杉醇+AC1MMYR2组。免疫荧光检测侵袭伪足的数目。Transwell和Wound Healing Assay分别检测细胞的侵袭和迁移能力。4.采用乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人脑胶质母细胞瘤细胞系U87VIII,mi R-21小分子抑制剂AC1MMYR2处理细胞24 h,RNA测序分析、GO分析及KEGG分析这个过程中mi R-21下游的靶基因。采用上述两种细胞系,实验设置为control组、紫杉醇组、AC1MMYR2组和紫杉醇+AC1MMYR2组,Western blot检测各组中CDK5、CDK5RAP1和p-FAKSer732的表达水平。采用上述两种细胞系,转染sh CDK5的慢病毒或CDK5过表达质粒,建立CDK5敲除和过表达的细胞系。实验设置为control组、紫杉醇组和紫杉醇+AC1MMYR2组,Western blot检测3种细胞系中E-cadherin、β-catenin和vimentin的表达水平。采用人脑胶质母细胞瘤细胞系U87VIII,实验设置为control组、紫杉醇组、AC1MMYR2组和紫杉醇+AC1MMYR2组,免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin、β-catenin及Tubulin-α的表达情况和亚细胞定位。5.采用乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人脑胶质母细胞瘤细胞系U87VIII,实验分为control组、AC1MMYR2组和紫杉醇+AC1MMYR2组,Western blot检测CDK5RAP1、Egr-1和p39的表达水平。采用上述两种细胞系,实验分为control组、Ig G组、AC1MMYR2组和紫杉醇+AC1MMYR2组,免疫共沉淀研究p39和CDK5之间的相互作用。采用上述两种细胞系,实验分为control组、AC1MMYR2组和紫杉醇+AC1MMYR2组,免疫荧光检测p39在细胞内的分布,Western blot检测p39在细胞核和细胞质中的表达水平。6.构建MDA-MB-231裸鼠乳腺癌原位模型,体内研究AC1MMYR2对紫杉醇诱导的肿瘤转移的影响。5*106转染luciferase慢病毒的MDA-MB-231细胞注射到裸鼠乳腺脂肪垫上,建立裸鼠乳腺癌原位模型,小鼠被随机分为四组(每组8只):PBS组、紫杉醇组、AC1MMYR2组和联合治疗组。小动物活体成像检测肿瘤大小和肺转移的荧光信号。H&E染色鉴定是否发生肺转移。免疫组化检测4种治疗组中CDK5和β-catenin的表达情况。结果1.根据TCGA数据库,我们发现与正常组织相比,mi R-21和CDK5在肿瘤组织中都是高表达的,且其差异具有统计学意义(P<0.05)。原位杂交实验发现,与无淋巴结转移的乳腺癌组织相比,转移性乳腺癌组织中mi R-21的荧光强度明显增强。免疫组化结果发现,在39例侵袭性乳腺癌组织中全部检测到CDK5的表达,但是在19例无淋巴结转移的乳腺癌组织中,只有7例检测到CDK5的表达。2.Western blot结果发现,与control组相比,低剂量紫杉醇组中E-cadherin的表达水平升高,β-catenin、vimentin和CDK5的表达水平显著降低;高剂量紫杉醇组中E-cadherin的表达水平显著降低,而β-catenin、vimentin和CDK5的表达水平显著增加(P<0.05)。此外,Real-time PCR结果发现,低剂量紫杉醇组中mi R-21的表达水平明显降低,而高剂量紫杉醇组中mi R-21的表达水平明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。3.免疫荧光显示,与control组相比,紫杉醇显著增加了MDA-MB-231和U87VIII细胞中侵袭伪足的数目,MDA-MB-231细胞中几乎增加了2~3倍,AC1MMYR2处理后显著降低了MDA-MB-231和U8VIII细胞形成侵袭伪足的能力;与紫杉醇处理组相比,紫杉醇+AC1MMYR2组中只形成了很少量的侵袭伪足。Transwell实验显示,与control组相比,紫杉醇显著增加了侵袭细胞的数目(P<0.05),AC1MMYR2处理组中侵袭细胞的数目明显降低;与紫杉醇处理组相比,紫杉醇+AC1MMYR2处理组中侵袭细胞的数目降低大约45%~55%。Wound Healing Assay结果显示,与control组相比,紫杉醇促进了两种细胞的迁移能力,而AC1MMYR2组中细胞的迁移能力受到了抑制;与紫杉醇处理组相比,紫杉醇+AC1MMYR2组中细胞的定向迁移受到了明显的抑制。4.根据RNA测序分析、GO分析和KEGG分析,我们发现只有CDK5RAP1(CDK5调节亚基相关蛋白1)是MDA-MB-231和U87VIII细胞中mi R-21共同的靶基因。Western blot显示,与control组相比,紫杉醇显著增加了CDK5及其下游靶p-FAKSer732的表达水平(P<0.05);AC1MMYR2和AC1MMYR2联合紫杉醇组中这两种蛋白的表达都明显减少(P<0.05),但CDK5RAP1的表达却显著升高(P<0.05)。Western blot结果显示,sh RNA介导的CDK5的沉默增强了E-cadherin的表达水平,与control组细胞相比,紫杉醇组和联合组中间质标志物β-catenin和vimentin的表达水平显著降低;相反,在转染CDK5过表达质粒的两种细胞系中,CDK5的过表达阻断了AC1MMYR2的作用,AC1MMYR2组和联合组中E-cadherin的表达减少(P<0.05),β-catenin和vimentin的表达增加(P<0.05)。此外,U87VIII细胞的免疫荧光结果发现,与control组相比,紫杉醇处理组中几乎检测不到E-cadherin的表达,β-catenin和N-cadherin的荧光强度明显增强;与紫杉醇处理组相比,联合组中E-cadherin的荧光强度增加,β-catenin的荧光强度降低,在细胞核中的分布减少,N-cadherin的荧光强度也降低;此外,与control组相比,紫杉醇处理组中Tubulin-α的荧光强度明显增强,Tubulin-α变得舒展,聚集在核周;与紫杉醇组相比,AC1MMYR2联合紫杉醇组中Tubulin-α的荧光强度明显降低,Tubulin-α变得卷曲。5.Western blot结果显示,与control组相比,AC1MMYR2和联合组中随着CDK5表达量的降低,CDK5RAP1和Egr-1的表达显著提高,而p39的表达量却减少。免疫共沉淀实验发现,在control组细胞中CDK5与p39相结合,而AC1MMYR2组和联合组中CDK5与p39之间的结合减少。免疫荧光显示,与control组相比,AC1MMYR2组和联合组中p39的荧光强度降低,p39在细胞核中的分布减少,转位到细胞浆。Western blot发现,与control组相比,细胞浆中p39表达水平降低,细胞质中p39表达水平也降低。6.建立MDA-MB-231乳腺癌裸鼠原位模型。小动物活体成像结果显示,与control组相比,紫杉醇治疗组在一定程度上抑制了肿瘤的生长,AC1MMYR2治疗组显著的抑制了肿瘤的生长;与紫杉醇治疗组相比,AC1MMYR2联合紫杉醇显著抑制了肿瘤的生长。治疗过程中对肿瘤体积的检测发现,与control组相比,紫杉醇治疗组在一定程度上抑制了肿瘤的生长,AC1MMYR2治疗组显著的抑制了肿瘤的生长;与紫杉醇治疗组相比,AC1MMYR2联合紫杉醇显著抑制了肿瘤的生长。肺部生物发光检测结果表明,与control组相比,紫杉醇治疗组增加了肺转移,AC1MMYR2治疗组没有肺转移;与紫杉醇治疗组相比,AC1MMYR2联合紫杉醇治疗组显著抑制了肿瘤的肺转移。H&E染色也得到了同样的结果。免疫组化发现,与control组相比,紫杉醇治疗组中CDK5和β-catenin的表达水平明显升高,AC1MMYR2组中这两种蛋白的表达水平显著降低;与紫杉醇治疗组相比,联合组中CDK5和β-catenin的表达水平显著降低。结论紫杉醇通过激活mi R-21/CDK5信号通路促进细胞转移,mi R-21的小分子抑制剂AC1MMYR2通过抑制mi R-21/CDK5RAP1/CDK5信号通路的活性,逆转紫杉醇药物诱导的细胞侵袭和转移,可作为临床紫杉醇治疗的潜在辅助给药方案,为增强紫杉醇药物治疗效果提供了新的思路和策略。