目的调查女性阴道正常菌群分布,筛选优势生长细菌,制备阴道微生态制剂,为细菌性阴道病微生态治疗提供实验依据。方法采集2018年10月至2019年3月华北理工大学附属医院及唐山妇幼保健院妇科体检中心健康体检女性阴道分泌物,通过常规镜检和细菌性阴道病联合检测试剂盒检测剔除非健康女性阴道分泌物标本。将符合标准的标本进行细菌培养,观察并记录菌落特点后纯培养,生化鉴定仪对分离细菌初步鉴定,应用实时荧光定量PCR进一步分子生物学鉴定。绘制健康女性阴道细菌频数分布直方图,选择健康女性阴道优势生长细菌作为阴道微生态制剂候选种子菌。传代培养确定种子菌最佳培养条件以及收获时间,采用冷冻干燥技术将混合种子菌制成粉末状阴道微生态制剂。采用均匀设计法对微生态制剂的保护剂进行优化以得到最高活菌率。从微生态制剂的耐酸性、含水量、保存条件等方面对其进行评估。结果1细菌分布调查249例健康体检女性阴道分泌物高倍镜镜检和细菌性阴道病联合检测中,有4例白细胞>15/HP,9例在高倍镜下发现孢子,1例在高倍镜下发现滴虫。1例标本唾液酸苷酶呈阳性,10例标本分泌物p H值>4.7,故剔除此25例标本。对符合条件的224例健康女性阴道分泌物标本细菌培养后生化反应初步鉴定,结果为:嗜酸乳杆菌123例,分离率54.9%;发酵乳杆菌98例,分离率43.8%;短小棒状杆菌68例,分离率30.4%;缓症链球菌37例,分离率16.5%;表皮葡萄球菌32例,分离率14.3%;马胃葡萄球菌28例,分离率12.5%;粪肠球菌19例,分离率8.5%。根据生化反应鉴定结果,选择相应引物进行基因鉴定,结果为:嗜酸乳杆菌122例,分离率54.5%;发酵乳杆菌98例,分离率43.8%;短小棒状杆菌59例,分离率26.3%;缓症链球菌37例,分离率16.5%;表皮葡萄球菌29例,分离率12.9%;马胃葡萄球菌28例,分离率12.5%;粪肠球菌19例,分离率8.5%。健康女性阴道细菌分布频数直方图显示,健康女性阴道优势菌为发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌及短小棒状杆菌,这三种细菌可以作为作为阴道微生态制剂的候选种子菌。2微生态制剂制备(1)细菌生长曲线表明,嗜酸乳杆菌与发酵乳杆菌在18～22h时,细菌生长处于平台期,短小棒状杆菌在20～24h时,细菌生长处于平台期。(2)通过冷冻干燥技术得到了乳白色无味的阴道微生态制剂。(3)微生态制剂保护剂单因素分析结果表明,脱脂乳粉在添加浓度14.0%时,得到最大活菌率70.30±0.28%,海藻糖在添加浓度4.0%时,得到最大活菌率60.40±0.41%,甘油在添加浓度1.5%时,得到最大活菌率64.40±0.37%,均匀设计实验显示复合保护剂最大活菌率为79.68%。(4)嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、短小棒状杆菌在溶液环境p H为4.0时,活菌率最高,分别为76.34%、74.32%和71.3%。(5)对阴道微生态制剂5个批次的含水量进行测定,结果分别为3.86%、4.42%、3.73%、4.06%、2.62%。(6)在温度为-20℃,时长为240天的条件下,微生物制剂中的活菌数大致维持不变,为1×1010cfu/g。当温度保持在4℃时,活菌的数量会逐渐减少,但仍然远高于国家对于益生菌制品里关于菌数的不少于106 cfu/g的要求。而在室温情况,即25-30℃下,制剂中的乳酸菌数量会迅速减少,在一个月内可以降至106cfu/g。结论1细菌分布调查嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、短小棒状杆菌为健康女性阴道内的优势生长细菌,可作为阴道微生态制剂的候选种子菌株。2微生态制剂制备(1)嗜酸乳杆菌与发酵乳杆菌在20h收获、短小棒状杆菌在24h收获,冷冻干燥后存活率最高。(2)复合阴道微生态保护剂脱脂乳粉、海藻糖、甘油浓度分别为14.0%、4.0%、1.5%条件下,活菌率最高(79.68%)。(3)在溶液p H为4.0的环境下,三种细菌的成活率最高。(4)所制备的阴道微生态制剂的含水量符合国家标准(≤5%)。(5)本次实验所制备的阴道微生态制剂在-20℃和4℃条件下可保存8个月。图11幅;表17个;参83篇。