银杏叶聚戊烯醇类化合物(Polyprenols from the Ginkgo biloba leaves,GP)是继银杏黄酮和萜内酯之后在银杏中发现的又一类极具开发价值的生物活性物质,由15～21个异戊烯基单元构成,在银杏叶中的含量可达1.0%～2.0%。研究表明,GP对高血压、糖尿病、慢性肝炎及肿瘤等具有明显作用,但关于其对阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)的相关研究尚未见报道。银杏是一类十分宝贵的医药资源,欧洲、日本以及韩国在内的许多国家对它的开发利用由来已久并且方兴未艾;中国作为银杏的故乡,拥有全世界70%以上的银杏资源,面对如此巨大的一个资源宝库,早日对其进行深入的挖掘和开发利用十分有必要。研究目的:以银杏叶为原料,对银杏叶中聚戊烯醇类化合物的提取、水解、纯化工艺及其稳定性作了较为系统地研究与分析,为其开发利用提供基础;建立体外拟AD细胞模型,在该模型基础上,对GP的神经保护作用进行研究,并从Aβ25-35诱导氧化应激及细胞凋亡途径激活的角度出发,初步探索GP发挥神经保护作用的潜在机制,为GP用于神经保护药物的研发提供一定的理论基础和参考依据。研究方法:1.利用单因素实验,以GP纯度及其得率为指标,考察溶剂种类、料液比、提取时间等因素对GP提取结果的影响,对其提取工艺进行优化。2.利用单因素实验,以GP纯度及其得率为指标,对皂化反应的条件参数进行筛选,主要包括皂化时间、皂化温度及皂化剂的种类和浓度,优化GP皂化水解工艺。3.以GP纯度为指标,对水解所得GP粗提物的进一步纯化作了研究,考察冷冻除蜡溶剂种类及温度、乙醇除杂的条件,并筛选了硅胶柱层析材料、洗脱剂和上样量。4.高效液相(HPLC)检测,分析条件是:色谱柱:KromasilC18 ODS1(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相:异丙醇:甲醇:正己烷:水=50:25:10:4;柱温:25℃;流速为1 mL/min;检测波长为:206 nm;进样量5 μL,检测时间:30 min;以标准品各峰保留时间对样品中相应峰定性,采用峰面积归-法测定样品中GP含量。5.研究温度、光照、pH值等因素对GP稳定性的影响。6.通过利用50 ng/mLNGF诱导PC12细胞分化,分化的PC12细胞(differentiated PC12,dPC12)具有神经细胞特性。采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT):(1)观察不同剂量GP(25、50、100、200、400 μg/mL)对dPC12增殖的影响,考察GP本身的细胞毒性作用;(2)观察不同剂量 Aβ25-35(6.25、12.5、25、50μM Aβ25-35)对 dPC12 细胞的损伤作用,筛选出最佳的刺激浓度(25 μM)用于建立体外拟AD细胞模型;(3)用不同浓度GP(25、50、100、200、400 μg/mL)对dPC12细胞预处理24 h后,给予25μM Aβ25-35继续培养24 h,通过MTT检测细胞活力,从中筛选出GP的有效保护剂量用于后续机制方面的研究。7.通过LDH 比色法检测GP对Aβ25-35处理后dPC12细胞存活率的影响;采用ROS、MDA试剂盒检测Aβ25-35对dPC12细胞的氧化损伤,并研究GP的抗氧化作用及其机制;流式细胞术检测细胞凋亡,比较各种浓度GP对dPC12细胞凋亡的影响;荧光实时定量 PCR 法(Real Time PCR)检测 Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 在 mRNA 水平的表达,并采用 Western Blot 法检测 Bax、Bcl-2、Caspase-3 及 Cleaved Caspase-3 等凋亡相关因子在蛋白水平的表达,综合探讨GP对Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤发挥保护作用的潜在机制。研究结果:1.以GP纯度为指标,优化了从银杏叶中提取聚戊烯醇类化合物的工艺条件,最佳工艺条件为:银杏叶采集后自然阴干,60℃烘干,破碎,过40-60目筛,60℃条件下热回流溶剂浸提,溶剂为石油醚,料液比1:10(g/ml),提取时间8h。2.采用水解法对银杏叶浸膏进行处理,最佳水解条件为:皂化液为5%NaOH-CH3OH溶液,料液比1:5(g/mL),60℃条件下进行热回流磁力搅拌水解,水解时间1h,此条件下不皂化物得率和聚戊烯醇纯度最高,分别为52.69%和40.96%。3.GP粗品在-5℃下采用丙酮:乙酸乙酯(9:1)混合溶剂处理的脱蜡效果最好,聚戊烯醇纯度可由原来的40.96%提高到51.09%;乙醇除杂对GP纯度提高有较为显著的影响。脱蜡后所得的浓缩物经80%乙醇水溶液适当处理后,纯度可由原来的40.96%提高到65.72%;柱层析的最佳工艺条件为:硅胶目数100-200目,洗脱溶剂为石油醚:乙酸乙酯(19:1,v/v),上样量为硅胶:样品(g/g)=50:1;样品在该条件下经柱层析纯化可使其纯度最高上升到95.27%。通过上述处理,能够有效去除GP粗提物中的胡萝卜素、叶黄素及一些小分子杂质,聚戊烯醇的流动性提高,粘度下降,颜色由黑色变为橘黄色,GP纯度明显提高。4.通过HPLC法对自制GP样品进行定性定量分析,在流动相:异丙醇:甲醇:正己烷:水=50:25:10:4;流速为1 mL/min,流动相冲洗30 min后,聚戊烯醇的各个同系物均被洗脱出来,出现聚戊烯醇的特征峰即“五指峰”。此外,对不同提取阶段得到的GP样品检测结果表明,经过各阶段处理,GP纯度逐渐提高,达到90%以上。5.温度对GP稳定性的影响较为显著,低温下比较稳定,温度越高,稳定性越差;酸碱度对GP稳定性亦有很大影响,中性条件下比较稳定,强酸或强碱条件下稳定性都比较差;相较于温度和pH值的影响,有无光照对GP稳定性的影响似乎并不大,但最好还是避光保存。6.MTT结果显示,细胞活性与Aβ25-35浓度呈负相关,即Aβ25-35浓度越高,dPC12细胞活性越低,其中25 μM Aβ25-35诱导的dPC12细胞损伤易于观察和检测;因此,25μM Aβ25-35被选为后续实验中的造模浓度。给予不同剂量的GP作用于dPC2细胞,未见细胞活性降低,可见在一定浓度范围内,GP对dPC12细胞没有细胞毒性作用。在Aβ25-35诱导损伤前24 h给予25、50、100、200及400μg/mL五个浓度的GP预孵育dPC12细胞,可对细胞产生剂量依赖性的保护作用,其中50～400 μg/mL的作用较为明显(P<0.01)。此外,由于200 μg/mL和400 μg/mL GP对dPC12细胞活性的保护作用并无明显差别,提示400 μg/mL GP可能是其对dPC12发挥最大保护作用的最大剂量;因此,50、100、200μg/mL GP被选为低、中、高三个给药剂量,用于后续保护机制的实验研究中。7.检测结果表明,Aβ25-35可诱导dPC12细胞氧化损伤,增加LDH漏出率,显著提高细胞内ROS水平和MDA含量;GP可明显降低LDH漏出率以及细胞内ROS水平和MDA含量,对dPC12细胞有显著的抗氧化作用。流式细胞术检测结果表明Aβ25-35可引起dPC12细胞凋亡明显增加,GP对该凋亡有一定的抑制作用,尤以高剂量组作用明显。Real Time PCR法检测凋亡相关蛋白基因表达水平的结果表明,Aβ25-35可诱导dPC12细胞内 Bax 和 Caspase-3 mRNA 表达上调,Bcl-2 mRNA 表达下调,Bax/Bcl-2 mRNA 比值增大,促进细胞凋亡;而GP能够显著下调Aβ25-35诱导损伤dPC12细胞内Caspase-3、Bax mRNA水平,并上调Bcl-2 mRNA水平,Bax/Bcl-2 mRNA 比值减小,抑制细胞凋亡;Western blot结果亦表明,Aβ25-35处理dPC12细胞内Caspase-3、Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少,Bax/Bcl-2比值增大,酶原活性Caspase-3激活裂解为有活性的Cleaved Caspase-3增多;而GP能够降低细胞内Caspase-3、Bax蛋白表达,增加Bcl-2蛋白表达,减小Bax/Bcl-2比值,抑制凋亡执行因子Caspase-3活化,从而抑制细胞凋亡。结论:Aβ25-35对dPC12细胞有毒性作用,有明显的剂量依赖性。GP对dPC12细胞安全无毒,并且GP对Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤有保护作用,可提高细胞活力,减少细胞凋亡。GP对Aβ25-35诱导的dPC12损伤发挥保护作用可能与其抗氧化作用和抑制细胞凋亡途径激活有关。课题意义:本课题对从银杏叶中提取、分离及纯化聚戊烯醇类化合物做了较为详细的研究;在纯化步骤,创新加入乙醇溶解除杂,效果较为明显。为实验室构建了一套GP自制的路线及条件参数,有利于后期针对GP进行更多潜在活性的研究。国内外尚未见到关于GP神经保护作用的相关研究,本课题为GP用于神经保护药物的研发提供了一定的理论基础和参考依据。