（1）生物钟基因Npas2在人乳腺癌中的表达及其临床意义目的：研究生物钟基因Npas2在乳腺癌中的表达，探讨其与乳腺癌发生、发展的关系。方法：应用免疫组织化学技术分析30例乳腺浸润癌、20例瘤旁正常乳腺组织、20例乳腺癌前病变（小叶原位癌10例和乳管内乳头状瘤10例）和20例乳腺纤维瘤中Npas2的表达情况。其中对10例乳腺小叶原位癌和30例乳腺浸润癌按国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行分期，其中T0期10例，I期9例、II期16例和III期5例；有淋巴结转移者11例，无淋巴结转移者19例。采用Motic Images Advanced3.2图像分析仪，在200倍镜下连续观察5个视野检测，测量灰度值，以灰度值表示Npas2蛋白阳性表达的高低，灰度值越小，说明Npas2蛋白阳性表达越高；灰度值越大，说明Npas2蛋白阳性表达越低。结果：Npas2蛋白在正常乳腺组织、乳腺癌前病变和浸润癌中均有表达，特异性着色位于细胞浆内，呈棕色颗粒。Npas2蛋白在正常乳腺组织中呈阳性表达，其灰度值为(114.3±2.31)，在浸润癌中表达明显降低，呈淡黄色或着色较浅，其灰度值(159.5±6.79)，两组比较差异有显著性意义。在乳腺癌前病变中呈阳性表达，其抗体灰度值为(132.3±2.11)，在乳腺纤维瘤中Npas2表达明显减弱或不表达，其灰度值(206.3±3.02)；在I期、II期和III期乳腺浸润癌中Npas2的表达依次降低，其抗体灰度值分别为(142.3±2.46)，(161.2±4.22)和(176.3±2.93)。与T0期和I期乳腺癌比较，在II期和III期乳腺癌中Npas2表达明显减弱，差异有统计学意义(P<0.05)。在乳腺浸润癌中，无淋巴结转移组和有淋巴结转移组Npas2表达的灰度值分别为(156.8±3.23)和(166.3±4.04)，两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。考虑可能纳入的样本数不够有关。结论：Npas2在乳腺癌中表达明显下调，与乳腺癌的发生、病理和临床分期关系密切。Npas2低表达与肿瘤瘤体大小、浸润深度有关，Npas2高表达可能是在乳腺癌发展中具有保护性作用。在乳腺癌癌前病变中Npas2表达增强，提示其可能在阻止癌前病变恶变中发挥作用。Npas2功能降低可能是乳腺癌发生的一个重要因素。（2）刺五加黄酮对MCF-7细胞系中Npas2和Per2表达的影响和抗肿瘤机制目的：通过检测刺五加黄酮对MCF-7细胞中Npas2和Per2的表达和对MCF-7细胞生长抑制作用以及对细胞增殖、凋亡相关蛋白表达和基因组稳定性的影响，探讨刺五加黄酮调节昼夜节律和抗肿瘤的机制。方法：采用MTT法检测不同浓度的刺五加黄酮对MCF-7细胞生长抑制作用；应用流式细胞仪检测刺五加黄酮对MCF-7细胞周期的影响；采用实时定量PCR的方法检测不同浓度的刺五加黄酮作用MCF-7细胞，不同时间点细胞周期相关蛋白Cyclin D1和P21转录的影响；应用免疫荧光染色方法检测刺五加黄酮对MCF-7细胞生物钟基因Npas2和Per2表达的影响，采用软件定量Npas2和Per2的荧光表达强度。采用Tunel细胞凋亡检测方法观察不同浓度的刺五加黄酮对MCF-7细胞凋亡的诱导作用，细胞凋亡指数评估采用同一视野中凋亡阳性细胞的百分率显示。采用免疫荧光法检测刺五加黄酮对MCF-7细胞Bax、Bcl-2和c-myc等凋亡相关蛋白表达水平的影响。采用实时定量PCR法观察Brg1转录水平的变化和采用免疫荧光法检测对Brg1蛋白表达的影响。采用Western Blotting方法检测刺五加黄酮作用MCF-7细胞，在6h、12h和24h时间点的总pRb和磷酸化pRb蛋白的表达变化。图像分析扫描蛋白条带灰度，以细胞内总pRb蛋白-磷酸化pRb蛋白灰度为去磷酸化pRb表达量，以ppRb/pRb和(pRb-ppRb)/pRb进行半定量分析。结果：浓度为100μmol/L的刺五加黄酮可使MCF-7细胞中Npas2和Per2表达强度明显增加(p<0.01)，能抑制MCF-7细胞在体外的增殖，且抑制作用有明显的剂量和时间依赖性。作用24h后在浓度低于75μmol/L时对MCF-7细胞生长没有抑制作用，甚至其抑制细胞生长作用反而下降，出现促进细胞增殖的现象；作用48h后抑制MCF-7细胞生长的浓度提前到75μmol/L。浓度为100μmol/L的刺五加黄酮作用MCF-7细胞后，使G1期细胞增多，S细胞减少，G2/M期细胞减少，表明刺五加黄酮既可阻止细胞由G1期进入S期，也可阻止进入分裂期，抑制细胞有丝分裂，表明刺五加黄酮可能通过改变细胞周期来抑制肿瘤细胞生长。浓度为50μmol/L刺五加黄酮作用MCF-7细胞24h后Cyclin D1基因转录水平明显增高，100μmol/L刺五加黄酮作用后Cyclin D1基因转录水平明显增高，且时间提前到6h，12h下降到正常水平。P21基因转录水平与刺五加黄酮的浓度无关，早期6h时间点转录增强，12-24h表达水平下降。正常培养的MCF-7细胞，偶见细胞凋亡阳性细胞，浓度为50μmol/L刺五加黄酮作用后细胞凋亡指数为0.8%，100μmol/L后细胞凋亡指数增加为5.2%，200μmol/L后细胞凋亡指数为12.6%，结果表明浓度为200μmol/L刺五加黄酮能诱导MCF-7细胞发生凋亡(p<0.01)。随着刺五加黄酮剂量增加，细胞凋亡指数也增加。浓度为100μmol/L的刺五加黄酮作用后，采用软件定量荧光表达强度显示Bax表达强度明显增加(p<0.01)，Bcl-2表达强度明显减弱(p<0.01)，c-myc蛋白表达强度明显减弱，Bax/Bcl-2比值明显增加。浓度为50和100μmol/L刺五加黄酮使Brg1基因转录6h有增高的趋势，12h时达峰值(p<0.01)，24h降至正常水平以下。100μmol/L的刺五加黄酮作用MCF-7细胞12h和24h后磷酸化pRb蛋白表达下降，去磷酸化的pRb蛋白增加，有明显统计学差异(p<0.05)。结论：1.浓度为100μmol/L的刺五加黄酮可使MCF-7细胞Npas2和Per2蛋白表达增强，Npas2和Per2蛋白表达增强可能是刺五加黄酮调整昼夜节律和抗肿瘤的机制；2.浓度为150μmol/L的刺五加黄酮在体外抑制MCF-7细胞增殖，通过改变细胞周期和调控细胞周期蛋白Cyclin D1和P21的表达抑制肿瘤细胞的增殖；3.浓度为200μmol/L刺五加黄酮可诱导细胞凋亡，通过下调抑制凋亡基因Bcl-2及上调促凋亡基因Bax的表达来诱导细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤的作用；4.浓度100μmol/L刺五加黄酮可促进MCF-7细胞Brg1、Npas2和Per2等基因的表达，提示生物钟基因Npas2和Per2及抑癌基因Brg1可能在乳腺癌发生中发挥作用。浓度为100μmol/L刺五加黄酮使MCF-7细胞pRB处于低磷酸化状态，调控细胞周期调控点使细胞周期停滞，使细胞有时间进行修复，维持DNA稳定，提示刺五加黄酮可能在维持基因组稳定性中发挥作用。