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乳酸杆菌携带不同的质粒,尤以θ复制质粒最为常见。本课题从酸奶发酵剂中分离得到一系列的乳酸菌,对这些乳酸菌株进行质粒分析,发现多数乳杆菌株含有质粒。其中一株乳酸菌菌株含有两个不同大小的质粒。通过对该菌株的16Sr RNA测序分析,并结合常规生理生化鉴定,将菌株定名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei MCJ（CCTCC AB20130356）。鉴于质粒是构建穿梭载体的良好元件,我们对干酪乳杆菌MCJ的小质粒（15kb以下）进行分离,酶切,并将纯化的DNA片段克隆到T载体p MD18T上进行测序,从而得到未知质粒的序列。依据已知序列进行引物设计,通过反向PCR扩增全质粒,进行测序。将测序结果用DNAstar7.1套件的Seqman进行拼接,得到1个完整的质粒序列,该质粒的大小为11274bp,G+C百分比为43.89%,携带9个开放阅读框。其中包含完整的海藻糖代谢所需的操纵子基因tre R,tre B,tre C,还包含有两个可能的theta复制子Rep1,rep2.质粒命名为p MC11。复制子rep1由3.5个正向重复序列（Direct Repeats,DR）和假定的复制蛋白基因rep A1,rep B组成。可能的复制起点为ori V1。复制子rep2由4.5个正向重复序列和假定的复制蛋白基因rep B1,rep A组成。通过克隆复制子ori V1和ori V2,与来自p MG36e的红霉素基因Em、p UC18的复制子构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒p EL5.6,p EL5.7。为了研究质粒的稳定性,我们通过连续的42℃高温传代消除质粒,得到不含p MC11质粒的菌株L.casei MCJΔ1。同时,为了找到最小的复制单位,通过对包含复制子的不同长度片段克隆,构建一系列质粒。以L.casei MCJΔ1为受体菌,转化子结果分析表明,rep1的最小的复制单位为:由rep A1和ori V2组成,rep B是非必须蛋白。而对于rep2,两个复制蛋白基因rep B-1、rep A和ori V1组成最小复制单位。电转化不同的受体菌株发现,p EL5.6能在干酪乳杆菌Lactobacillus casei MCJΔ1、L.casei NJ、L.paracasei LPC-37、L.delbrueckii subsp.lactic LBCH-1中复制传代,而p EL5.7仅仅能在L.casei MCJΔ1、L.delbrueckii subsp.lactic LBCH-1中复制传代。对质粒的稳定性分析发现,在非选择条件下,每代质粒丢失率低于1%,表明两个穿梭质粒在干酪乳杆菌中都十分稳定。此外,p EL5.7在乳酸德氏乳杆菌中稳定性也很高,每代质粒丢失率低于3%。通过比较不同的启动子的活性,最终选择嗜酸乳杆菌的S层蛋白启动子Slp A,连同多克隆位点和终止信号tt,构建了两个表达质粒p ELX1和p ELX2。用增强的绿色荧光蛋白e GFP作为标记,检测了外源蛋白在胞内表达状况。分析表明,不同菌株中GFP的表达与细胞生长时期有相关性。对数生长期荧光强度最高,细胞生长后期虽然总蛋白量增加,但荧光显微镜检查发现荧光减弱,说明Slp A启动子在干酪乳杆菌中能正常识别,并受宿主菌细胞调控。对p MC11质粒上的一个未知基因ORF8进行分析,发现是一个膜蛋白。融合GFP表达测试穿膜区,用溶菌酶和蛋白酶K进行处理菌体,并用GFP抗体做western杂交,结果表明,ORF8的C端和截短的125a.a处都在膜外,是一个很好的膜锚定标签候选。至此,本课题成功构建了一个基于干酪乳杆菌的窄宿主表达系统。该系统有潜力作为乳酸菌研究的重要遗传工具和潜在的疫苗表达工具,具有良好的应用前景。