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背景
巨噬细胞是机体内具有吞噬功能的一类固有免疫细胞，在机体免疫防御反应中起着重要作用，对固有免疫应答和适应性免疫应答都具有重要意义。巨噬细胞对微生物感染反应迅速，能通过直接吞噬或释放多种炎症介质消灭病原体。巨噬细胞在接受LPS等刺激物刺激后能够通过NF-κB、MAPK等信号通路将活化信号传递入细胞核并促进TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12等炎症因子的转录，从而引起巨噬细胞的活化。在此过程中，DNA甲基化修饰、组蛋白甲基化和乙酰化等表观遗传修饰均发挥着重要作用。
RNA甲基化是目前表观遗传学研究最前沿的热点之一。m6A是真核生物信使RNA(Messenger RNA, mRNA)中丰度最高的修饰方式，广泛存在于真核细胞mRNA中，主要富集于mRNA外显子区域和3’-非编码区域(3-UTR)，对RNA加工、代谢具有重要调控作用。m6A修饰过程中与腺嘌呤第6位N原子上连接的一个氢原子(-H)被甲基基团(-CH3)取代，该修饰过程是可逆的，由甲基转移酶和去甲基化酶共同调控。m6A甲基转移酶复合体包括METTL3(Methyltransferase-like protein 3)、METTL14和WTAP，而FTO(Fat mass and obesity-associated protein)和ALKBH5(AlkB Homolog 5)则是主要的m6A去甲基化酶。mRNA上的m6A修饰可被YTH结构域家族(YT521-B homology domain family)的蛋白(如YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1)和核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclearribonucleoprotein，HNRNP)识别结合并发挥不同的生物学功能。
METTL3是首先被鉴定出来的一种m6A甲基转移酶，负责在mRNA上“写入”甲基，并参与mRNA的转录、降解和翻译控制。研究表明敲低METTL3可导致m6A水平的降低并诱导HeLa细胞和HepG2细胞发生凋亡，提示METTL3对细胞生存起着重要调控作用。在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中均能检测到METTL3的异常高表达，表明METTL3可能参与肿瘤的发生发展。值得注意的是，m6A修饰对免疫系统的影响近年来也不断被发现，因此催化该修饰的酶对免疫细胞功能的影响也引起了广泛的注意。研究表明METTL3在促进T细胞稳态及树突状细胞活化过程中都发挥着重要作用，然而METTL3在巨噬细胞活化中的作用仍有待进一步明确。本论文的研究将有助于从mRNA修饰角度明确巨噬细胞活化的表观遗传学调控机制，为在肿瘤等疾病中靶向巨噬细胞的治疗策略提供新的思路。
目的
明确m6A甲基转移酶METTL3在LPS诱导的巨噬细胞活化过程中的作用及对巨噬细胞炎症反应信号通路的影响，并通过生物信息学技术分析转录组测序数据，初步探究METTL3调控巨噬细胞活化的可能机制。
方法
体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞，并以1μg/mL脂多糖(LPS)刺激，检测不同时间点METTL3的表达情况。设计合成针对小鼠METTL3的小干扰RNA(siRNA)敲低METTL3的表达，通过实时定量PCR和WesternBlot法检测干扰效率；利用siRNA下调METTL3表达48h后，以1μg/mLLPS刺激RAW264.7细胞，采用实时定量PCR检测IL-6、TNF-α、IL-12、IL-1β的mRNA水平，WesternBlot法检测NF-кВ和MAPK信号通路中P65、P38、ERK、IKKα/β、JNK及其磷酸化水平。从转染siMETTL3的RAW264.7细胞和对照RAW264.7细胞中分离出RNA，根据是否给与细胞LPS刺激分组，分别进行转录组测序，借助生物信息学技术从测序结果中分析METTL3影响巨噬细胞活化的可能机制。
结果
本研究利用小干扰RNA技术敲低了巨噬细胞中的METTL3的表达，通过实时荧光定量PCR和WesternBlot等技术检测了敲低METTL3对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的生成和NF-кВ、MAPK等炎症相关信号通路分子的表达变化，并利用转录组测序数据技术和生物信息学方法分析了METTL3在LPS诱导巨噬细胞活化中的作用及可能的调控机制。
LPS刺激后RAW264.7细胞METTL3的表达上调，设计合成的METTL3siRNA能有效敲低METTL3的水平。敲低METTL3后，巨噬细胞LPS刺激诱导表达的IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β等炎性因子与对照组相比在0.5、1、2、3h均显著降低，降低的倍数峰值出现在1h附近。
敲低METTL3后伴有NF-кВ信号通路P65磷酸化水平和IKKα/β磷酸化水平降低以及MAPK通路中JNK、ERK的磷酸化水平降低，提示敲低METTL3可导致NF-кВ和MAPK信号通路活化水平受到抑制，并进而抑制促炎因子和趋化因子的表达。
对转录组测序结果的生物信息学分析结果显示敲低METTL3后，巨噬细胞对LPS的应答水平降低，多种信号通路的关键分子表达水平发生改变，其中尤以TNF信号通路变化最为明显，提示其可能是METTL3调控巨噬细胞活化的可能机制。
结论
1.mRNA的m6A甲基化修饰参与了LPS诱导的巨噬细胞活化过程，干涉METTL3会抑制LPS诱导的炎性因子的生成；
2.敲低METTL3后NF-кB信号通路和MAPK信号通路活化受到抑制；
3.转录组测序结果显示敲低METTL3后巨噬细胞免疫应答水平降低，TNF信号通路可能在此过程中发挥重要作用。
巨噬细胞是机体内具有吞噬功能的一类固有免疫细胞，在机体免疫防御反应中起着重要作用，对固有免疫应答和适应性免疫应答都具有重要意义。巨噬细胞对微生物感染反应迅速，能通过直接吞噬或释放多种炎症介质消灭病原体。巨噬细胞在接受LPS等刺激物刺激后能够通过NF-κB、MAPK等信号通路将活化信号传递入细胞核并促进TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12等炎症因子的转录，从而引起巨噬细胞的活化。在此过程中，DNA甲基化修饰、组蛋白甲基化和乙酰化等表观遗传修饰均发挥着重要作用。
RNA甲基化是目前表观遗传学研究最前沿的热点之一。m6A是真核生物信使RNA(Messenger RNA, mRNA)中丰度最高的修饰方式，广泛存在于真核细胞mRNA中，主要富集于mRNA外显子区域和3’-非编码区域(3-UTR)，对RNA加工、代谢具有重要调控作用。m6A修饰过程中与腺嘌呤第6位N原子上连接的一个氢原子(-H)被甲基基团(-CH3)取代，该修饰过程是可逆的，由甲基转移酶和去甲基化酶共同调控。m6A甲基转移酶复合体包括METTL3(Methyltransferase-like protein 3)、METTL14和WTAP，而FTO(Fat mass and obesity-associated protein)和ALKBH5(AlkB Homolog 5)则是主要的m6A去甲基化酶。mRNA上的m6A修饰可被YTH结构域家族(YT521-B homology domain family)的蛋白(如YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1)和核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclearribonucleoprotein，HNRNP)识别结合并发挥不同的生物学功能。
METTL3是首先被鉴定出来的一种m6A甲基转移酶，负责在mRNA上“写入”甲基，并参与mRNA的转录、降解和翻译控制。研究表明敲低METTL3可导致m6A水平的降低并诱导HeLa细胞和HepG2细胞发生凋亡，提示METTL3对细胞生存起着重要调控作用。在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中均能检测到METTL3的异常高表达，表明METTL3可能参与肿瘤的发生发展。值得注意的是，m6A修饰对免疫系统的影响近年来也不断被发现，因此催化该修饰的酶对免疫细胞功能的影响也引起了广泛的注意。研究表明METTL3在促进T细胞稳态及树突状细胞活化过程中都发挥着重要作用，然而METTL3在巨噬细胞活化中的作用仍有待进一步明确。本论文的研究将有助于从mRNA修饰角度明确巨噬细胞活化的表观遗传学调控机制，为在肿瘤等疾病中靶向巨噬细胞的治疗策略提供新的思路。
目的
明确m6A甲基转移酶METTL3在LPS诱导的巨噬细胞活化过程中的作用及对巨噬细胞炎症反应信号通路的影响，并通过生物信息学技术分析转录组测序数据，初步探究METTL3调控巨噬细胞活化的可能机制。
方法
体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞，并以1μg/mL脂多糖(LPS)刺激，检测不同时间点METTL3的表达情况。设计合成针对小鼠METTL3的小干扰RNA(siRNA)敲低METTL3的表达，通过实时定量PCR和WesternBlot法检测干扰效率；利用siRNA下调METTL3表达48h后，以1μg/mLLPS刺激RAW264.7细胞，采用实时定量PCR检测IL-6、TNF-α、IL-12、IL-1β的mRNA水平，WesternBlot法检测NF-кВ和MAPK信号通路中P65、P38、ERK、IKKα/β、JNK及其磷酸化水平。从转染siMETTL3的RAW264.7细胞和对照RAW264.7细胞中分离出RNA，根据是否给与细胞LPS刺激分组，分别进行转录组测序，借助生物信息学技术从测序结果中分析METTL3影响巨噬细胞活化的可能机制。
结果
本研究利用小干扰RNA技术敲低了巨噬细胞中的METTL3的表达，通过实时荧光定量PCR和WesternBlot等技术检测了敲低METTL3对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的生成和NF-кВ、MAPK等炎症相关信号通路分子的表达变化，并利用转录组测序数据技术和生物信息学方法分析了METTL3在LPS诱导巨噬细胞活化中的作用及可能的调控机制。
LPS刺激后RAW264.7细胞METTL3的表达上调，设计合成的METTL3siRNA能有效敲低METTL3的水平。敲低METTL3后，巨噬细胞LPS刺激诱导表达的IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β等炎性因子与对照组相比在0.5、1、2、3h均显著降低，降低的倍数峰值出现在1h附近。
敲低METTL3后伴有NF-кВ信号通路P65磷酸化水平和IKKα/β磷酸化水平降低以及MAPK通路中JNK、ERK的磷酸化水平降低，提示敲低METTL3可导致NF-кВ和MAPK信号通路活化水平受到抑制，并进而抑制促炎因子和趋化因子的表达。
对转录组测序结果的生物信息学分析结果显示敲低METTL3后，巨噬细胞对LPS的应答水平降低，多种信号通路的关键分子表达水平发生改变，其中尤以TNF信号通路变化最为明显，提示其可能是METTL3调控巨噬细胞活化的可能机制。
结论
1.mRNA的m6A甲基化修饰参与了LPS诱导的巨噬细胞活化过程，干涉METTL3会抑制LPS诱导的炎性因子的生成；
2.敲低METTL3后NF-кB信号通路和MAPK信号通路活化受到抑制；
3.转录组测序结果显示敲低METTL3后巨噬细胞免疫应答水平降低，TNF信号通路可能在此过程中发挥重要作用。