第一部分增强型绿色荧光蛋白与内皮抑素共表达载体的构建　　 目的：构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和人内皮抑素(hES)基因共表达载体。　　 方法：在hES两端设计并合成分别带有Hind Ⅲ和Sal I两酶切位点的一对引物，对pCI-hES载体进行PCR扩增。将扩增产物和pIRES2-EGFP载体同时用Hind Ⅲ和Sal I双酶切，回收片段，连接，将目的基因片段插入pIRES2-EGFP相应的酶切位点。产物转化大肠杆菌，提取质粒进行酶切分析，获取的质粒进行PCR扩增，鉴定，菌液送检进行DNA序列分析。　　 结果：重组克隆载体内的目的基因片段序列与GENEBANK上报道的hES基因序列基本一致，pIRES-EGFP/hES酶切鉴定结果与预期结果一致。　　 结论：本实验成功构建了EGFP和hES基因共表达质粒pIRES2-EGFP/hES。　　 第二部分超声/微泡介导内皮抑素基因转染小鼠骨骼肌的实验研究　　 目的：采用超声爆破微泡技术介导pIRES2-EGFP/hES质粒转染小鼠骨骼肌，证实该方法转基因的有效性。　　 方法：选取60只健康雄性昆明小鼠，随机分为6组:P组(单独pIRES2-EGFP/hES质粒)、P+UCA组(pIRES2-EGFP/hES质粒加微泡)、P+US组(pIRES2-EGFP/hES质粒联合超声照射)、P+UCA+US组(pIRES2-EGFP/hES质粒加微泡，联合超声照射)、C+组(pIRES2-EGFP质粒加微泡，联合超声照射)和C-组(阴性对照组，未加任何处理)，质粒注入胫前肌后进行超声照射(MI1.5，2 min)，转基因7d后取胫前肌做冰冻切片，观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，同时进行ES免疫组化检测ES的表达。　　 结果：荧光显微镜下观察，C-组未见GFP表达；P组和P+UCA组GFP表达量较少，两组间比较差异无统计学意义(P=0.764)；P+US组GFP表达增多，与第P组和P+UCA组比较差异有统计学意义(P<0.01)； P+UCA+US组与C+组有较多的GFP表达，两组间比较差异无统计学意义(P=0.328)，但两组与其他组比较差异有统计学意义(P<0.01)。小鼠胫前肌ES免疫组化检测可见P+UCA+US组多数细胞胞浆内有明显棕褐色颗粒；P+US组有少量淡染，其余各组未见明显棕褐染色。小鼠胫前肌及肝肾组织病理检测未见明显病理改变。　　 结论：一定照射条件下，超声/微泡可有效介导目的基因转染小鼠骨骼肌并表达。　　 第三部分兔颈动脉粥样硬化模型的建立及影像学检查　　 目的：采用内膜空气干燥术联合高脂饲料喂养法建立家兔颈动脉粥样硬化模型，利用超声动态观察动脉内膜的变化，同时探讨血管新生对粥样斑块的作用。　　 方法：选取36只健康雄性日本大耳白兔，随机分为2组:对照组(18只)，正常饲料喂养，不予任何处理；模型组(18只)，实施右侧颈总动脉(RCCA)内膜空气干燥术，术后喂以高脂饲料。于分组前、术后4w、8w和12w分别采血检测血脂水平；同时进行超声检测，观察动脉内膜的动态变化及血流动力学参数的改变；于术后4w、8w、12w时每组各处死6只实验兔，取血管进行病理检测，观察血管内膜的变化。　　 结果：正常对照组随喂养时间延长血脂变化不明显，而模型组于建模4w时开始血脂明显升高，以总胆固醇(TC)变化最为显著，且随时间延长保持较高水平，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。超声检查可见模型组RCCA内中膜厚度(IMT)随喂养时间的延长而逐渐增厚，内径逐渐变细，收缩期峰值流速(PSV)升高。病理检测可见对照组内膜无增生，而模型组内膜随喂养时间延长逐渐增厚，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对于IMT的测量，超声与病理比较差异无统计学意义(P>0.05)。CD34染色显示对照组血管内膜未见明显阳性染色，而模型组斑块内有较多CD34阳性染色，且随斑块增大，斑块内CD34阳性染色增多。　　 结论：利用内膜空气干燥术和高脂喂养法可成功建立兔颈动脉粥样硬化模型；超声可动态观察动脉粥样硬化的病变发展情况；随病变的发展内膜逐渐增厚，斑块内新生血管增多。　　 第四部分超声/微泡介导内皮抑素基因治疗兔颈动脉粥样硬化的实验研究　　 目的：利用超声爆破微泡技术介导内皮抑素基因转染兔颈动脉粥样硬化模型，探讨利用此方法转染表达的内皮抑素对兔颈动脉粥样硬化的抑制作用。　　 方法：选取20只健康雄性日本大耳白兔，随机分为3组:A组，UCA+US，无质粒；B组，pIRES2-EGFP+UCA+US；C组，pIRES2-EGFP/hES+UCA+US。分组后采用内膜空气干燥术和高脂喂养法建立兔颈动脉粥样硬化模型，于建模后2w开始进行超声/微泡介导的基因转染。超声照射条件:MI1.5，照射5 min。分别于转基因后1d、7d、14 d和21 d时采集血清，利用ELISA法检测血清中ES的浓度。间隔21d时重复转染1次。于建模后14 w进行血脂检测、超声及DSA检查。14 w时取血管进行病理检测。　　 结果：ES基因转染后1 d有极少量ES表达，7d时ES表达增加，至14 d时达高峰，21d时有所下降。至建模14 w时三组血脂比较差异无统计学意义(P>0.05)。超声和DSA显示A组和B组内膜明显增厚，管腔明显狭窄，血流速度增加，但A组和B组比较差异无统计学意义(P>0.05)；C组则上述指标均明显较A组和B组低(P<0.05)。病理检测显示IMT、IT、IT/MT、lA、IA/MA、新生内膜狭窄率比较，A组和B组间差异无统计学意义(P>0.05)，C组与A组和B组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。C组新生血管数目及血管VEGF表达均较A组和B组低(P<0.05)，A组和B组间差异无统计学意义(P>0.05)。ES免疫组化染色显示C组的颈动脉内膜及胫前肌均可见ES表达，而A组和B组则几乎无表达。三组肝脏损伤无明显差别，肾脏及其他内脏未见明显异常。　　 结论：一定超声照射条件下，超声/微泡介导内皮抑素基因转染可抑制兔颈动脉粥样硬化病变的发展，可为动脉粥样硬化性疾病的基因治疗提供一种新的有效方法。