在人类骨骼肌肉运动系统中,韧带组织与骨组织通过一种被称为附着点的特化的界面组织结构进行连接。这种组织在两种生理和生物力学性质差异巨大的结构中起到了关键的过渡作用。韧带-骨界面通过力学强度的逐渐升高,减小了韧带与骨之间的应力集中,从而实现了机械力的平滑传导和对界面两端组织的保护。然而,由于其在骨骼肌肉运动系统中的关键作用,在运动损伤以及退行性疾病中,韧带-骨界面结构经常受累,而其高度特化的组织成分和相对脆弱的内部结构,使其在损伤后难以通过临床和组织工程手段进行修复。临床上常用的韧带移植重建方法(如自体韧带或异体韧带经骨隧道固定重建)往往导致移植韧带在骨隧道固定区域形成功能较差的瘢痕愈合,长期随访结果不良。而在组织工程领域,韧带-骨界面支架的构建也存在诸如细胞成分的异质性、支架形态的灵活性以及制造难度高等诸多挑战。生物打印是增材制造技术的一个分支,其具有“自下而上”的,与生物体生长方式类似的结构构建模式,从而实现对复杂精细的生物组织结构的仿生制造。近年来,随着生物打印技术的发展,已经出现了诸如骨、软骨及肌肉组织生物打印及体外培养等一系列组织工程学应用。然而,由于韧带-骨界面组织的特殊性,生物打印技术在韧带-骨界面修复领域尚未有应用出现。在材料方面,韧带-骨界面结构的构建需要在相对较小的尺度下进行精细结构的打印,同时打印结构的宏观尺寸又往往需要根据实际情况进行定制,这就要求用于该结构生物打印的生物墨水材料具备较高的可打印性以实现良好的打印精度,同时又具备一定的机械性能,从而提供在生物打印复杂定制结构过程中结构整体的自支撑性和打印结束后进一步组织工程学实验的可操作性。此外,细胞来源也是生物打印韧带-骨界面结构的另一个挑战,尽管骨、软骨等骨组织工程常见细胞成分均已实现了生物打印,但是构成韧带-骨界面结构关键成分的纤维软骨细胞的生物打印应用仍然未见报道。实现对韧带-骨界面结构和成分的生物打印,重建其特殊的结构和功能,仍然是该领域的一个空白。针对目前存在的挑战,本研究自主设计建造了基于微挤出原理的生物打印机,并通过加入纤维素纳米纤维(CNF)对现有的明胶-海藻酸钠生物墨水体系进行了改良。在此基础上进一步对韧带-骨界面结构中的主要细胞成分进行了生物打印测试,验证了打印结构的生物活性和生物功能性。具体研究方案包括以下三个部分:1)微挤出式生物原理的论证和生物打印机的设计建造本研究总结通过对微挤出式生物打印基本原理的分析,对研究中需要的能够进行骨骼肌肉界面结构生物打印的设备和材料进行总体设计,并总结一系列表征手段,对打印精度、设备实用性等生物打印技术的基本性能进行评估。再根据研究需求,自主构建了微挤出式生物打印机(BP-1)。2)明胶-海藻酸钠-纤维素纳米纤维生物墨水的配制、表征、打印参数优化和可打印性验证根据实验要求和生物打印机的性能指标,本研究使用纤维素纳米纤维(CNF)对明胶-海藻酸钠水凝胶体系进行了改性,配制了多种成分配比的明胶-海藻酸钠-CNF水凝胶材料,并通过对其进行流变学分析和可打印性测试,优化筛选具备最佳可打印性和自支撑性能、并可进行复杂定制化结构打印能力的生物墨水。使用CNF改良的明胶-海藻酸钠生物墨水较对照组在流变学特性和机械强度上获得了显著的提升。在可打印性测试中,显著改善了打印结构的精细度和平滑度。同时,CNF的加入使生物墨水在打印过程中获得了较好的自支撑性,实现了复杂仿生结构的打印。在生物打印样品扫描电镜检测中,水凝胶样品展现出了与细胞外基质类似的多级孔隙结构。实现了对细胞外基质微环境的形态仿生。3)韧带-骨界面结构主要细胞成分的生物打印和生物活性、生物功能性验证本研究将生物打印设备及生物墨水材料应用于韧带-骨界面组织的生物打印中,对成骨细胞和纤维软骨细胞这两种界面结构的主要细胞成分进行了生物打印。细胞活死染色和代谢速率检测证实搭载纤维软骨细胞和成骨细胞的样品在生物打印后都保持了良好的细胞活性。组织学和免疫组化染色证实了打印结构在体外培养的过程中分泌和积累了界面结构相关的细胞外基质。综上所述,本实验自主设计开发的生物打印机系统和配套的改进型生物墨水展现出了较高的生物打印精度和灵活的可定制性,并在韧带-骨界面结构细胞成分的生物打印中实现了良好的生物相容性,首次实现了韧带-骨界面主要细胞成分的生物打印,在韧带-骨结构组织工程领域有巨大的应用潜力。在后续的研究中,将继续在设备、材料和组织工程三个方面深入研究,在设备方面进一步完善设计,提升打印精度和复杂度,在材料方面进行更深入的力学测试,在组织工程方面引入动物体内植入实验,探索生物打印结构在动物体内的组织化、血管化及功能化的实现方法。最终实现对韧带-骨界面结构的全面仿生生物制造。