红曲菌的分离鉴定及酯酶特性研究

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本论文以26株红曲菌为供试菌株,在形态学鉴定、酯酶同工酶分析的基础上,对代表性菌株rDNA ITS、5.8S、18S区序列进行扩增并测序,并对18S区进行PCR-DGGE分析,旨在为红曲菌种的准确、快速鉴定提供依据;对代表性红曲菌产酯酶条件进行优化,酯酶经过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G25层析、聚乙二醇浓缩进行初步纯化,并对其部分酶学性质进行研究,探讨酿酒材料中红曲菌酯酶的基本性质,具有一定的理论意义和实践价值。主要研究结果如下:(1)以分离自酱香型大曲、酒糟、浓香型大曲中的20株红曲菌、实验室保存的红曲菌6株,共26株为供试菌株,根据李钟庆和郭芳等的分类方法,通过菌落形态和显微特征观察,初步鉴定出供试菌株中12株为烟色红曲菌(Monascus fuliginosus),13株紫色红曲菌(Monascus pupureus),1株红色红曲菌(Monascus ruber),共3个种。(2)采用优化后酯酶同工酶电泳法(NY/T1097-2006)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了25株供试菌株的酯酶同工酶。结果表明,种间的酯酶同工酶电泳带型具有多样性,种内菌株间带型基本一致,与形态学鉴定基本吻合。聚类分析结果显示,在相似度55%处,25个菌株分为2个群,紫色红曲菌单独为一群,烟色红曲菌、红色红曲菌属同一群。(3)在形态学、酯酶同工酶分析的基础上筛选出13株代表性菌株,对rDNA5.8S、ITS、18S进行PCR扩增测序,并对18S区进行PCR-DGGE分析。结果表明,ITS1区系统进化树将供试菌株分为三类,与形态学鉴定结果基本吻合;18S区系统进化树将供试菌株分为2类,紫色红曲菌为一类,烟色红曲菌与红色红曲菌属同一类;ITS2、5.8S区只在一定程度上体现菌株间亲缘关系远近,不足以用于红曲菌种间分类;PCR-DGGE分析在谱带位置及强度基础上,将供试菌株分为4类,更快速、较准确地反映出碱基序列的差异。(4)对不同来源的红曲菌产酯酶活力、酯化酶活力的差异进行比较,并对不同来源的代表性红曲菌株产酯酶条件进行优化,结果表明:①不同来源菌株产胞内酶活力均高于胞外酶;分离自酱香型曲的菌株MY8产胞内酯酶、胞外酯酶均极显著(P<0.01)高于其余菌株,浓香型曲菌株MY10、MY11产胞外酯酶极显著(P<0.01)高于其余菌株(除MY8外);Z1酯化酶活力极显著(P<0.01)高于其余供试菌株;②筛选出红曲菌产胞内酯酶最优条件为:培养基初始pH5.0、培养温度32℃、接种量2mL、培养时间5d。(5)对不同来源的代表性红曲菌胞内、胞外酯酶进行初步纯化,并对胞内酯酶部分酶学性质进行测定,结果表明:①硫酸铵初级、次级沉淀最佳饱和度分别为40%,80%; Sephadex G25层析上样量为0.5mL,流速0.5mL·min-1,菌株M5分离得到两种胞内酯酶同工酶,菌株Q5、MY10得到两种胞外酯酶同工酶,供试菌株经Sephadex G25层析纯化倍数,胞外酯酶在6.4~14.1倍,胞内酶在5.4~6.5倍。②酯酶最适温度为35℃,在50℃中90min,酶活力保存率为40%-65%,最适pH为5.0,在偏中性环境中酶活力保存较好。不同化学物质和金属离子,Ca2+,Mg2+对酯酶活力有促进作用,其余物质对酯酶有不同程度的抑制作用。
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