【摘 要】
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目的:构建含有HSV-tk和MCP-1融合基因的逆转录病毒表达载体。构建分别含有HSV-tk和MCP-1单基因的逆转录病毒表达载体。 方法:经分离人外周血单个核细胞(peripheral blood
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目的:构建含有HSV-tk和MCP-1融合基因的逆转录病毒表达载体。构建分别含有HSV-tk和MCP-1单基因的逆转录病毒表达载体。 方法:经分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA以反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法扩增MCP-1基因片段,扩增产物纯化后克隆至测序载体pUCm-T vector,挑选阳性克隆经鉴定后测序,将测序正确的MCP-1基因从测序载体相应酶切位点消化后回收并纯化。HSV-tk目的基因片段来源于pWZLneoTKglyCD质粒,IRES基因片段来源于MINV质粒。利用内部核糖体进入位点(IRES)将HSV-tk基因与MCP-1基因连接并通过定向克隆方法插入至pLXSN表达载体的多克隆位点间,连接产物常规转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,经筛选后随机挑选阳性菌落提取质粒,酶切鉴定插入片段的大小、位置,以获得含正确目的基因的逆转录病毒表达载体pLXSN/tk-MCP-1。将目的基因HSV-tk和MCP-1从相应酶切位点消化后,回收并纯化,分别与经同样双酶切后的线性化载体pLXSN连接,其后的转化、筛选及鉴定方法与HSV-tk/MCP-1融合基因表达载体基本相同,以分别获得含正确目的基因的真核表达载体pLXSN/HSV-tk和pLXSN/MCP-1。 结果:经限制性酶切分析及PCR方法鉴定,各插入基因及融合基因的大小、位置和方向均正确无误,从而成功构建了pLXSN/tk-MCP-1、pLXSN/HSV-tk和pLXSN/MCP-1三个逆转录病毒表达载体。 结论:HSV-tk/MCP-1融合基因表达载体以及分别含HSV-tk和MCP-1单基因表达载体的成功构建为卵巢癌的免疫基因治疗提供了部分实验基础,也为表达具有多功能活性的新型融合基因和发现趋化因子新的生物学功能提
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