间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能，在其分化过程中并不发生DNA序列的改变，但在不同环境或不同诱导条件下，可选择性地稳定表达某些特定的基因，其机制目前认为是表观遗传学修饰的结果。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要形式之一，它能够在不改变基因组中碱基排序的前提下影响基因转录和表达，但目前有关MSCs向神经细胞分化调中的相关基因的DNA甲基化修饰的改变尚不清楚，这些基因包括Oct4、神经细胞特异性微管相关蛋白Tau、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)等。　　 Oct4因子属于POU转录因子家族，是干细胞多能性控制的核心机制，在多能干细胞中高表达，分化时静默。已有研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)在向神经细胞分化前表达Oct4，分化后则检测不到Oct4的表达；而神经细胞特异性微管相关蛋白Tau和神经元特异性烯醇化酶NSE，在BMSCs向神经细胞前均不表达，在分化后特异性表达。但这种改变的机制尚不清楚，是否与DNA甲基化修饰的变化有关尚待研究。本实验研究了BMSCs向神经细胞分化过程中Oct4、Tau和NSE基因表达的甲基化修饰的变化，以进一步探明BMSCs的分化调控机制。　　 目的：　　 体外诱导BMSCs分化成神经细胞，检测分化前后的Oct4、微管相关蛋白Tau和神经特异性烯醇化酶NSE基因启动子区甲基化状态改变情况，研究启动子区甲基化对BMSCs向神经细胞分化中Oct4、Tau和NSE基因表达的影响，探讨DNA甲基化调控在BMSCs向神经细胞分化中的作用。　　 方法：　　 1．体外分离培养大鼠骨髓MSCs，通过反复传代纯化BMSCs直至第四代。　　 2．用化学诱导法(BHA/DMSO)诱导第四代BMSCs向神经细胞分化；用肝细胞生长因子诱导其向肝细胞分化。　　 3．免疫细胞化学法鉴定分化细胞中Tau、NSE和甲胎蛋白(Alpha Fetal Protein，AFP)的表达。　　 4．提取BMSCs、BMSCs分化神经细胞、BMSCs分化肝细胞（对照）、脑组织（对照）和肝组织（对照）的基因组DNA。亚硫酸氢盐修饰后进行MSP测序，检测Oct4、Tau和NSE基因启动子区甲基化状态。　　 5．用SPSS12.0软件进行统计分析，检验水准α=0.05。　　 结果　　 1．体外分离培养大鼠骨髓MSCs至第四代，细胞贴壁生长，呈梭形，旋涡状排列。　　 2．BMSCs向神经细胞诱导分化后，呈现神经细胞样形态，具有多个突起，NSE和Tau蛋白免疫细胞化学染色阳性；BMSCs向肝细胞方向诱导分化后，细胞集落呈贴壁或轻微粘附生长，形态呈现片状生长肝细胞样细胞群，AFP免疫细胞化学染色阳性。　　 3．MSP测序法检测Oct4基因启动子区（-293bp～-85bp），包括4个CpG位点（-217bp、-207bp、-165bp、-113bp位点）。甲基化修饰位点/CpG位点(％)在BMSCs、BMSCs分化神经细胞、BMSCs分化肝细胞、脑组织和肝脏组织中均维持较高水平（均＞75％），显著高于胚胎干细胞(0％)。Oct4启动子区-113bp的CpG在BMSCs维持低甲基化状态，明显低于BMSCs分化后的神经细胞、BMSCs分化后的肝细胞、脑组织和肝组织。　　 4．MSP测序法检测Tau启动子区（-239bp～+131bp，含55个CpG位点）和NSE启动子区（-214bp～+57bp，含30个CpG位点）甲基化位点，结果发现Tau启动子区和NSE启动子区在BMSCs、BMSCs分化神经细胞和脑组织中均保持未甲基化状态，Tau启动子区未甲基化修饰位点占所有CpG位点的比率依次为98.9％、100％和100％:NSE启动子区依次为100％、100％和99.3％，组间无明显差异(P＞0.05)。　　 结论：　　 1．骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中，Oct4启动子区甲基化程度增高，其甲基化增高修饰位点在-113bp，这可能是Oct4表达沉默、BMSCs丧失多能性并分化成熟的机制。　　 2．骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后虽然Tau和NSE的表达量增高，但Tau和NSE启动子区甲基化水平在分化前后未发生改变，均处于低甲基化水平，且与成年脑细胞一致，提示DNA甲基化可能不参与BMSCs向神经细胞分化过程中NSE和Tau表达的调节