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第一部分Semaphorin4D和血管生成拟态在非小细胞肺癌中的表达及临床意义目的：探讨Semaphorin4D和血管生成拟态在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法：运用免疫组化法检测60例非小细胞肺癌和10例肺良性病变组织中Semaphorin4D (Sema4D)蛋白的表达,并采用PAS糖原染色及免疫组化双重染色法检测血管生成拟态(Vasculogenic mimicry, VM)的表达,分析Sema4D和VM与各临床因素间的相关性。结果：Sema4D在非小细胞肺癌(NSCLC)和肺良性疾病组织中的表达：Sema4D蛋白主要表达于细胞胞浆中,60例NSCLC组织中Sema4D表达阳性率为65%,10例肺良性疾病中表达阳性率为30%,Sema4D在NSCLC中的表达高于肺良性疾病组织(P<0.05)。在肺良性病变组织中未发现VM,23.3%的非小细胞肺癌组织中发现VM阳性表达。存在VM的NSCLC组织中Sema4D的表达高于无VM组,Sema4D阳性组中VM的表达高于Sema4D阴性组,两者具有相关性(r=0.322,P<0.05)。Sema4D在NSCLC组织中的表达与临床病理因素的关系：Sema4D阳性组的NSCLC比Sema4D阴性组分化差(P<0.05)；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期Sema4D阳性率48.4%,Ⅲ-Ⅳ期Sema4D阳性率82.8%,Ⅲ-Ⅳ期患者组织中有更多Sema4D的表达(P<0.05),且Sema4D阳性组淋巴结转移率更高(P<0.05)。VM与临床因素的关系：低分化的NSCLC中42.3%存在VM,而中-高分化组VM阳性率为8.8%(P<0.05)；VM在Ⅰ-Ⅱ期NSCLC中阳性表达率(9.7%)低于Ⅲ-Ⅳ期(37.9%),差异有统计学意义(P<0.05)；淋巴结受累的NSCLC中VM表达更多(P<0.05)。结论：VM和Sema4D在非小细胞肺癌中的表达均高于肺良性病变组织,两者具有相关性,且表达VM和/或Sema4D的NSCLC分化差、TNM分期较晚、易发生淋巴结转移,VM和Sema4D或可作为判断NSCLC预后的独立因素。第二部分慢病毒介导的siRNA靶向沉默肺癌细胞株Semaphorin4D目的：构建靶向Semaphorin4D (Sema4D)的RNA干扰慢病毒载体,并感染肺癌H358、A549、H460及H1975细胞株,检测感染慢病毒载体前后Sema4D mRNA和蛋白表达水平的变化,为后续研究提供实验基础。方法：设计靶向沉默Sema4D的siRNA序列,构建慢病毒载体并通过基因检测鉴定。慢病毒载体感染4种不同病理类型肺癌细胞株(A549、H358、H460及H1975)。应用实时荧光定量PCR (RT-PCR)和Western blot法分别检测感染前后4种细胞中Sema4D在mRNA以及蛋白水平的表达变化。结果：靶向Sema4D的RNA干扰慢病毒载体成功感染肺癌A549、H358、H460及H1975细胞株。感染后4株肺癌细胞中Sema4D在mRNA以及蛋白水平的表达与未处理组(CON组)及感染对照病毒组(NC组)相比明显降低(P<0.05),CON组与NC组间比较无统计学差异(P>0.05)。结论：所构建的靶向Sema4D的RNA干扰慢病毒载体能够有效地沉默肺癌A549、H358、H460及H1975细胞株中Sema4D的表达,可用于后续实验。第三部分RNA干扰靶向沉默Semaphorin4D对肺癌细胞株血管生成拟态形成及迁移侵袭能力的影响目的：探讨慢病毒介导的RNA干扰靶向沉默Semaphorin4D (Sema4D)对肺癌细胞株A549、H358、H460和H1975血管生成拟态形成及侵袭迁移能力的影响。方法：构建肺癌A549、H358、H460和H1975细胞株血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)的体外三维培养模型,运用小管形成实验检测已成功感染靶向Sema4D的RNA干扰慢病毒载体的肺癌A549、H358、H460及H1975细胞株形成VM管道的能力变化,运用Transwell小室法检测它们迁移和侵袭能力的变化。结果：成功构建肺癌A549、H358、H460和H1975细胞株血管生成拟态的体外三维培养模型,其中H1975细胞所形成的VM管道周长及面积均最大。4株肺癌细胞均分为RNAi组(感染靶向Sema4D的RNA干扰慢病毒载体组)、NC组(感染对照慢病毒载体组)及CON组(未做处理组),4株肺癌细胞中RNAi组的VM管道周长及面积均小于NC组及CON组(P<0.05),而NC组与CON组间比较无统计学差异(P>0.05),其中肺癌H358细胞RNAi组未见VM形成。体外迁移及侵袭实验中,4株肺癌细胞中RNAi组穿膜细胞数均明显少于NC组和CON组(P<0.05),而NC组与CON组穿膜细胞数比较无统计学差异(P>0.05)。结论：靶向Sema4D、RNA干扰慢病毒载体可以有效抑制肺癌A549、H358、H460和H1975细胞株血管生成拟态的形成及迁移侵袭能力,提示Semaphorin4D在肺癌血管生成拟态及迁移侵袭中起促进作用,Sema4D有可能成为非小细胞肺癌治疗的新靶点。