研究背景肝癌是严重威胁人类生存健康的恶性肿瘤之一,有较高的发病率和死亡率。我国肝癌发病率约占全球的55%,并且发病率正在逐年上升。手术切除治疗是目前最为有效的治疗方式,但是大部分病人在确诊时已是晚期,从而失去了手术治疗的机会。外周血肿瘤标志物对于疾病的早期诊断和预后监测具有十分重要的意义。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)是临床上常用的肝癌诊断标志物,但其灵敏度较低,因此需要新的肿瘤标志物以提高疾病的诊出率。随着蛋白质组学技术的不断完善和发展,使大规模、高通量的分析肿瘤相关蛋白成为可能,为寻找新的肿瘤标志物开辟了新途径。研究目的本课题以占肝癌发病率80%以上的肝细胞肝癌(Hepatocellular cacinoma,HCC)为研究对象,旨在建立HCC相关的分泌／释放蛋白质数据库,通过筛选和鉴定血浆中的候选蛋白标志物,以辅助AFP提高HCC的诊断效能。同时,分析候选标志物同病人预后的关系,挖掘其监测HCC病人的术后复发与转移的潜在效能。实验方法本实验室在前期工作中建立了无血清原代器官(组织)培养模型,通过对6例伴有HBV (Hepatitis B virus, HBV)感染的HCC癌组织及其对应的癌旁非肿瘤组织进行体外无血清培养,收集其无血清条件培养基(Conditioned medium,CM),经一维SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)分离后,采用LC-MS/MS (Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry)质谱鉴定条件培养基中的蛋白质,以建立HCC分泌／释放蛋白质数据库。随后,采用GOFFA、ArrayTrack、STRING生物信息学分析软件对鉴定出的条件培养基蛋白数据进行GO (Gene Ontology)富集和分子网络分析。挑选出同HCC发生相关的候选蛋白,采用双抗体夹心ELISA法检测候选蛋白在179例HCC病人、80例肝硬化病人以及103例健康人群外周血血浆中的含量。Mann-Whitney检验分析不同组间蛋白含量的差异。构建候选蛋白标志物的ROC(Receiver operating characteristic curve)曲线,分析候选蛋白对HCC的诊断效能。采用Kaplan-Meier法分析候选蛋白标志物血浆中蛋白水平同病人无病生存期和总生存期的关系。随后,对妊娠特异性糖蛋白-9(Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein9, PSG9)在血管生成的作用进行了初步探讨。采用qPCR (Real-time quantitative PCR)检测HCC癌组织和癌旁非肿瘤组织中PSG9和VEGFA(Vascular endothelial growth factor A) mRNA的表达。采用Western blot方法检测9株HCC细胞系中PSG9蛋白的表达情况。在细胞系中瞬时过表达PSG9和敲降PSG9表达后,分析其对VEGFA mRNA和蛋白水平的变化。利用双荧光素酶报告基因实验分析PSG9对VEGFA启动子区的影响,染色质免疫共沉淀实验检测PSG9作用于VEGFA启动子区的作用位点。构建稳定过表达和低表达PSG9的SMMC7721细胞系,CCK8细胞增殖实验检测PSG9对细胞增殖能力的影响。采用人脐带静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)成血管实验和Matrigel plug实验分析PSG9对血管生成的影响。实验结果通过质谱分析HCC条件培养基共鉴定出1365个蛋白,建立了HCC分泌/释放蛋白质数据库。GO分析表明,其中定位于细胞外和细胞膜的蛋白占总蛋白的19%。总蛋白的分子功能和生物学过程主要富集在水解酶活性、蛋白质代谢、催化功能等途径,与肝脏作为人体重要的代谢器官相符。ArrayTrack信号传导通路分析结果表明,CM蛋白主要参与了人类疾病相关的信号通路。本研究中选择了在伴有HBV感染的HCC发生过程中起到重要作用的TGF-β(Transforming growth factor β)通路相关的蛋白质进行分析。比较了此通路中的7个蛋白,MMP1(Matrix metalloproteinase1)、MMP7、MMP9、OPN(Osteopontin)、 PSG9、TIMP1(Tissue inhibitor of metalloproteinase1)以及AFP在HCC、肝硬化病人及健康人群血浆中的蛋白水平。ELISA结果显示,相比于其他实验组,HCC病人中MMP1、OPN、PSG9血浆水平最高,并且MMP1、OPN、PSG9在健康人、肝硬化、到HCC病人血浆蛋白水平呈逐次上升的趋势。MMP7、MMP9、TIMP1在肝硬化病人的外周血中含量显著高于健康人和HCC病人。通过对MMP1、OPN、PSG9蛋白诊断效能进行分析,MMP1和OPN从肝硬化病人中区分HCC效能要好于AFP, AFP的ROC曲线下面积(Area under the receiver operating characteristic curve, AUC)为0.642,MMP1为0.945,OPN为0.911。分析血浆蛋白水平同HCC病人预后的关系,发现血浆中OPN和PSG9是可以作为预测预后不良的独立因素,血浆中OPN和PSG9水平高预示病人预后差。PSG9的功能进行初步研究结果表明,PSG9是参与肿瘤血管生成的生物分子。在癌组织中PSG9与VEGFA mRNA表达水平呈正相关。在HCC细胞系中过表达PSG9会促进VEGFA的表达,反之,降低PSG9的表达会抑制VEGFA的表达。双荧光素酶报告基因实验表明PSG9与VEGFA的启动子区具有相互作用。染色质免疫共沉淀将其作用位点定位于VEGFA启动子上游-1684/-1766处。HUVEC成血管实验和Matrigel plug实验表明PSG9具有促进血管生成的作用。结论本项研究建立了HCC分泌释放蛋白质组数据库,为在血液中寻找相关肿瘤标志物提供了可靠的资源。初步筛选出可供提高HCC诊断效能的分子标志物MMP1和OPN,以及预后相关血浆蛋白OPN和PSG9。另外,本研究揭示PSG9通过调控VEGFA的表达来促进肿瘤血管生成,提示了其造成HCC不良预后的作用机制。