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研究背景股骨头坏死是以股骨头血供破坏,股骨头内成分坏死,导致患者关节功能障碍、疼痛的骨科常见疾病,高发于青壮年。大量的患者因此最终不得不行关节置换术,为社会带来了沉重的负担。在我国,激素的应用为股骨头坏死发生的首要原因。由于激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)的发病机制尚不明确,因而影响了对患者的早期诊断和治疗。虽然许多学者经过长期的研究提出了包括脂质代谢紊乱学说、骨髓间充质干细胞的成骨减弱学说、细胞凋亡学说和基因多态性等在内的多种学说,但SONFH的确切发病机制尚不完全清楚,仍需要进一步深入研究,目前仍是研究的热点和难点。已有学者从非编码RNA角度研究SONFH发病机制,特别是微小RNA(micro RNA,miRNA)与SONFH发病之间的关系,已经获得了一些成果。然而目前仍然缺乏环状RNA(Circular RNA,Circ RNA)与SONFH发生机制的相关研究。因此,本研究首次以circ RNA为切入点,旨在通过高通量芯片筛查SONFH患者股骨头坏死区组织样本,初步探寻环状RNA在SONFH发生发展中的作用机制。研究目的借助高通量的竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,CeRNA)芯片技术获取环状RNA在SONFH患者组织中的表达谱,并对结果进行验证。利用生物信息学技术分析预测非编码RNA调控的靶基因和信号通路。对差异表达的环状RNA进行相关功能研究,探讨其可能的作用机理,初步揭示环状RNA在SONFH形成中的CeRNA机制,为后期深入阐明SONFH的发病机制建立基础,最终为寻找SONFH潜在的早期诊断分子标记物或治疗靶点提供科学依据。研究方法本课题利用CeRNA芯片对收集的三对SONFH病变组织和相邻的正常组织进行高通量检测,获取差异基因表达谱。利用生物信息学的手段进行分析,研究差异基因的表达谱特征,并进行聚类分析和富集分析。收集10对SONFH患者的病变组织及邻近对照组织样本,借助实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerasechain reaction,qPCR)技术对候选的10个差异表达基因在组织样本上进行扩大样本验证。并对差异表达的候选circ RNA进行成环验证。通过生物信息学手段预测与hsa＿circ＿0058122结合的miRNAs以及其下游靶基因分子。体外构建地塞米松处理人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的模型。为研究hsa＿circ＿0058122的功能,分别针对hsa＿circ＿0058122设计过表达载体和三条跨环化剪切点的小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA),荧光定量PCR检测干扰效率。使用流式细胞仪检测hsa＿circ＿0058122过表达和干扰对各组HUVECs细胞凋亡的影响情况。利用免疫印迹试验(western blot,WB)检测各组HUVECs细胞凋亡蛋白的水平。荧光定量PCR分析hsa-miR-7974,人胰岛素样生长因子结合蛋白-5(Human Insulin Like Growth Factor Binding Protein-5,IGFBP5)在各组HUVECs细胞中的表达,WB检测IGFBP5蛋白的水平。双荧光酶报告基因实验分析hsa＿circ＿0058122和hsa-miR-7974的结合。荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)检测hsa＿circ＿0058122和hsa-miR-7974共定位。荧光定量PCR检测手术样本中hsa-miR-7974的表达水平,分析其表达情况与hsa＿circ＿0058122表达的相关性。研究结果1.本研究借助CeRNA芯片初步筛选SONFH患者的组织样本,共鉴定出647个差异表达的circ RNA(差异倍数≥2倍,P≤0.05),包括433个上调的和214个下调的circ RNA。并且共鉴定出436种差异表达的LncRNA(差异倍数≥2倍,P≤0.05),包括210种上调的基因和226种下调的基因。此外,鉴定出222种差异表达的m RNA(差异倍数≥2倍,P≤0.05),包括113种上调的基因和109种下调的基因。通过对miRNA,m RNA和circ RNA共表达的网络分析,我们发现环状RNA与miRNA和m RNA之间的联系非常紧密。2.荧光定量PCR验证芯片初筛结果,发现6个环状RNA分子及3个LncRNA分子在10对组织样本中表达存在明显差异(P≤0.05)。其结果与芯片检测结果一致。成环鉴定实验证实了6个环状RNA分子的环形结构。3.流式检测细胞凋亡显示:HUVEC细胞中过表达hsa＿circ＿0058122可增加细胞凋亡的比例,干扰hsa＿circ＿0058122则降低凋亡比例。激素处理条件下,过表达hsa＿circ＿0058122后凋亡的比例更高,而干扰hsa＿circ＿0058122后凋亡比例有所下降。在激素处理和过表达has＿circ＿005812的HUVEC细胞组中,促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3高表达,抑制凋亡蛋白Bcl-2低表达(P≤0.05);在干扰has＿circ＿0058122的HUVEC细胞组中,促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3低表达,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达升高(P≤0.05)。实验结果表明,激素处理和过表达has＿circ＿0058122均可诱导HUVEC细胞发生凋亡;敲减has＿circ＿0058122可抑制HUVEC细胞发生凋亡。4.基于ceRNA网络分析的结果,我们预测到hsa＿circ＿0058122可以竞争性结合miR-7974。miR-7974在10例患者的股骨头坏死区组织样本中低表达。在配对的10例正常骨组织中高表达,差异有统计学意义(P≤0.05)。miR-7974与hsa＿circ＿0058122在组织样本中的表达模式相反。双荧光素酶检测实验结果表明,hsa-miR-7974与hsa＿circ＿00058122存在相互作用。在FISH实验中,观察到hsa＿circ＿0058122与miRNA的杂交信号存在共定位,并且hsa＿circ＿0058122和miR-7974均定位于细胞质中。5.在激素处理和过表达hsa＿circ＿00058122的HUVEC细胞组中,hsa-miR-7974的表达量显著下调;在敲减hsa＿circ＿00058122的HUVEC细胞组中,hsa-miR-7974的表达量显著上调;在激素处理的HUVEC细胞模型中过表达hsa＿circ＿00058122,has-miR-7974的表达量显著下调;在激素处理的HUVEC细胞模型中敲减hsa＿circ＿00058122,hsa-miR-7974的表达量显著上调。综上,hsa＿circ＿00058122的在细胞中的表达模式与hsa-miR-7974相反,激素处理或高表达hsa＿circ＿00058122均可使hsa-miR-7974表达量下调。6.利用qPCR和Western检测了预测的has-miR-7974下游靶基因IGFBP5,结果显示:在激素处理组和过表达hsa＿circ＿0058122的HUVEC细胞组,IGFBP5的表达量均上调(P≤0.05);在干扰hsa＿circ＿0058122的HUVEC细胞组中,IGFBP5的表达量下调(P≤0.05);在激素干预的细胞模型中,干扰hsa＿circ＿0058122后,IGFBP5表达量与HUVEC空白细胞组相比无明显变化(P>0.05)。研究结论本次研究首次报告了SONFH患者组织内circRNA差异基因表达谱。并在组织样本中验证了6个环状RNA分子的差异表达,显示circRNA与SONFH的发生发展具有相关性。研究发现hsa＿circ＿0058122可吸附hsa-miR-7974并诱导早期凋亡。初步证实了hsa＿circ＿0058122通过ceRNA机制调控IGFBP5的表达。揭示了相关基因可能通过诱导血管内皮细胞的凋亡而引起股骨头坏死的发生。我们推测IGFBP5是SONFH治疗的一个潜在靶点。本次实验发现的差异表达的环状RNA和预测的相关ceRNA分子在SONFH发生中的作用机制值得更深入的研究。