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目的:构建Bmi-1shRNA慢病毒表达载体以沉默Bmi-1基因的表达,建立稳定干扰Bmi-1基因的骨髓瘤细胞株;研究Bmi-1基因沉默对骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226生物学特性及对硼替佐米敏感性的影响及其机制。方法:设计合成一对针对Bmi-1mRNA的shRNA序列,利用分子克隆技术构建慢病毒表达载体—pLVTHM-shBmi-1,空载体作为对照组,分别与包装载体psPAX2及PMD2.G共转染HEK293T细胞,包装出高滴度的病毒颗粒;感染骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226,经过流式细胞仪分选获得稳定细胞株。接着应用real-time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1及p14的表达;CCK-8法检测稳定株细胞增殖;克隆形成实验检测稳定株细胞克隆形成能力;流式细胞术(FCM)检测稳定株细胞周期和凋亡的变化;AO/EB染色、Hoechst33258荧光染色法观察稳定株细胞凋亡形态;Western blot检测P21、Bax和Bcl-2蛋白水平改变。进一步,采用CCK-8法、克隆形成法、流式细胞术和荧光染色法分别从细胞增殖、克隆形成、细胞周期和凋亡、Western blot等方面研究Bmi-1基因沉默对骨髓瘤细胞硼替佐米敏感性的影响及其机制。结果:(1)成功构建慢病毒表达载体pLVTHM-shBmi-1。(2)成功建立稳定细胞株:real-time PCR和Western blot结果显示干扰组细胞Bmi-1mRNA和蛋白水平表达均下调,说明稳定干扰Bmi-1的骨髓瘤细胞株成功建立。(3) Bmi-1基因沉默对稳定株细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响:○1CCK-8结果显示:48~96小时与对照组相比,U266及RPMI8226干扰组细胞增殖抑制率分别为22.83~25.1%和13.9~26.9%;○2克隆形成显示:Bmi-1基因沉默抑制骨髓瘤细胞的克隆形成能力;○3流式细胞仪检测细胞周期结果显示:U266细胞:对照组和干扰组G1期细胞比率分别为39.91%±0.26%和45.65%±0.68%;RPMI8226细胞:对照组和干扰组G1期细胞比率分别为42.7%±0.47%和50.86%±0.38%;○4流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:U266细胞:对照组和干扰组的凋亡率分别为9.8%及12.12%,RPMI8226细胞:对照组和干扰组的凋亡率分别为9.6%及15.69%。(4) Bmi-1基因沉默增强骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性:○1不同浓度的硼替佐米分别处理对照组和干扰组细胞72小时,细胞增殖明显受抑制,干扰组联合用药作用更明显,IC50分别为: U266对照组24.73nmol/L,干扰组18.59nmol/L;RPMI8226对照组32.99nmol/L,干扰组21.56nmol/L;○2联合40nmol/L硼替佐米处理细胞48小时,干扰组细胞加药周期阻滞更明显:U266细胞:对照组和干扰组G1期细胞比率分别为45.35%±0.77%和56.81%±0.50%;RPMI8226细胞:对照组和干扰组G1期细胞比率分别为49.27%±0.90%和56.94%±0.61%;○3联合40nmol/L硼替佐米处理细胞48小时,干扰组细胞凋亡率增加:U266细胞:对照组和干扰组的凋亡率分别为20.83%和28.14%,RPMI8226细胞:对照组和干扰组的凋亡率分别为22.5%和49.14%;○4Western blot检测p21、Bcl-2、Bax蛋白水平结果显示:干扰组p21、Bax表达上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,加药处理后上述改变更明显。结论:(1)干扰Bmi-1后可抑制骨髓瘤细胞增殖,抑制克隆形成,促进凋亡,细胞周期阻滞于G1期;(2) Bmi-1沉默能够增强骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,Bmi-1可能成为多发性骨髓瘤基因治疗的一个有效靶点。