本论文以在畜牧养殖场和饲料生产企业广泛使用的饲料药物添加剂金霉素作为研究对象,系统研究了金霉素作为饲料药物添加剂经由动物摄入后在动物粪便中的排泄残留、降解、吸附迁移等一系列环境行为及其作为肥料施用于土壤后对土壤微生物的毒性效应。论文首先建立了畜禽排泄物中金霉素(CTC)的DAD-HPLC检测方法和畜禽粪便和污水中金霉素及两种代谢物差向金霉素(ECTC)和异金霉素(ICTC)的LC-ESI-MS/MS检测方法,并调查了82家规模化养殖场畜禽粪便和55个污水样品中金霉素及两种代谢物的污染水平；在此基础上,研究了金霉素作为饲料药物添加剂在生长猪和肉鸡饲料中应用后在排泄物中的排泄残留及其在粪便中的降解和吸附迁移动态；同时研究了金霉素随鸡粪作为肥料施用于农田土壤后对土壤微生物的生态毒性效应。本论文包括三大部分研究：1)金霉素及其代谢物检测方法的建立和养殖场畜禽粪便和污水中金霉素及两种代谢物的污染调查；2)金霉素经动物排泄后在粪便中的环境行为；和3)粪源金霉素暴露对土壤微生物的生态毒性研究,共六章实验内容,现分述如下：1.畜禽粪便和污水中金霉素及其主要代谢物检测方法的研究建立本研究首先建立了畜禽排泄物(鸡排泄物、猪粪便和猪尿)中金霉素残留检测的HPLC检测方法。该方法提取程序简单、回收率高、成本低。猪粪和鸡排泄物经提取液(丙酮：水：4mol.L-l盐酸溶液,v/v/v,13:6:1)震荡提取后,离心过滤,HPLC检测,猪尿液直接提取离心后检测。分离色谱柱采用ZORBAX SB-C18,流动相为乙二酸+甲醇+乙腈(10+2+3),在紫外检测器波长375nm下进行检测,CTC浓度在O.5mg.kg-1～ 10.0 mg.kg-1之间,标准曲线成线性相关,相关系数(R2)为0.9999,在0.5mg.kg-1～ 5.0mg.kg-1浓度添加范围内,平均回收率为79.6%～92.78%,变异系数为3.88%～10.2%,检测限为0.5mg.kg-1。符合检测方法的要求。为进一步提高检测灵敏度和代谢物的分离效果,本研究同时建立了畜禽粪便及污水中CTC及其两种代谢物ECTC和ICTC的LC-MS/MS检测方法。粪便样品经Na2EDTA-McIlvaine缓冲液缓冲液(pH=4)提取三次,离心,收集上清液,过Waters的Oasis HLB固相萃取小柱净化、浓缩。用6mL 0.01mol.L-1草酸甲醇洗脱,收集洗脱液,40℃水浴氮气吹至近干,甲醇定容至1mL,过0.22um滤膜,用LC-MS/MS测定。污水取100mL经滤纸和0.65μm纤维膜过滤后,加1mL 5% Na2EDTA溶液,调节pH至7.0,然后过预先用5mL甲醇和10mLNa2EDTA-McIlvaine缓冲液(pH=4)活化过的Waters Oasis HLB固相萃取小柱,净化、浓缩,后用6mL 0.01mol.L-1草酸甲醇洗脱,收集洗脱液,40℃水浴氮气吹至近干,甲醇定容至1mL,过0.22um滤膜,上机测定。该方法在10μg.L-1～1000μg.L-1之间呈线性相关。金霉素、差向金霉素和异金霉素的平均回收率分别在79.64%～97.23%、75.34%～98.37%和73.67%～95.08%之间,日间偏差在1.78%-6.18%,日内偏差在1.07%-6.28%。粪便样品和污水样品中的检测限分别为中20μg.Kg-1和10μg.L-1,符合作为检测方法的要求。2.规模化畜禽养殖场粪便及污水中金霉素及两种代谢物的污染调查本研究在2008-2009年间采集了82个规模化养殖场(猪场、牛场和鸡场)畜舍内的新鲜畜禽排泄物(猪粪、牛粪和鸡排泄物)和55个养殖场排污口和附近周围污水样品,其中猪粪主要采自4月龄以内小猪的新鲜粪便,其中养殖场周围污水样品取自养殖场下游2Km以内的地表水。分别测定了粪便和污水中CTC及两种代谢物ECTC和ICTC的污染水平及分布情况。结果发现：在82个畜禽粪便样品中有69.51%检出CTC污染,51.22%和32.93%的粪便样品检出有ECTC和ICTC残留,污染水平最高分别达72.8 mg.kg-1DM、26.37 mg.kg-1 DM和13.67 mg.kg-1 DM;其中CTC和ECTC的最高浓度是在猪粪中检出的,而ICTC的最高浓度是在牛粪中检出的。从粪便来源动物来看,CTC和ECTC的检出率及污染水平是：猪粪>鸡排泄物>牛粪,仅有ICTC的检出率是：牛粪>鸡粪>猪粪。三种化合物的污染情况来看,不论动物品种,三种化合物的检出率和污染水平都是：CTC>ECTC>ICTC,这可能与CTC在动物体的代谢和在粪便中的降解有关。在55个污水样品中,CTC在养殖场排污口和周围水体中的检出率都超过50%,分别为57.1%和51.90%,ECTC的检出率都在40%左右,而ICTC在周围水体中的检出率为25%,高于排污口ICTC的检出率10.7%,这可能是CTC随排污水进入养殖场周围附近湖泊和河流后,水体环境条件变化,致使金霉素代谢产物ICTC的含量增加。三种化合物污染的最高浓度都集中在排污口污水中,最高分别达29.12μg.L-1、32.43μg.L-1和69.2μg·L-1。两个采样点相比,排污口CTC检出率高于周围水体,而ECTC和ICTC的检出率是周围水体比排污口高,这可能与CTC在环境中的降解、代谢以及迁移有关。同时研究还发现：水样中的三种化合物残留浓度由高到低为ICTC>ECTC>CTC。调查结果显示：畜禽养殖场畜禽粪便及其周围水体中金霉素及其代谢物的污染较为严重,有的甚至高于国家规定的作为饲料药物添加剂的推荐剂量(猪25-75mg.kg-1;鸡为20-50mg.kg-1),这可能存在较大的环境安全隐患。3.金霉素在动物粪便中的排泄残留动态研究本研究以21日龄AA肉鸡和2月龄左右的苏钟猪为实验动物,研究了金霉素作为饲料添加剂经动物摄食后在动物粪便中金霉素及两种代谢物的残留水平及排泄总量。实验以36羽健康21日龄AA肉鸡和18头体重约为(21.5±1.87)Kg的苏钟猪为实验动物,采用经典代谢实验和全收粪法,定量给药后,收集动物不同时间的排泄物,测定其中金霉素及两种代谢物残留浓度。结果发现：肉鸡分别摄入含金霉素40.45mg.kg-1和197.64mg.kg-1饲料后,分别有62.88%、71.67%的以金霉素原形和两种代谢物的形式残留于肉鸡排泄物,在排泄总量中金霉素与两种代谢物分别占35.69%、19.4%、7.79%和39.57%、23.36%、8.74%。猪摄入含金霉素40.78和216.31g.kg-1的饲料后,分别有摄入量的59.27%和67.83%以金霉素原形、差向金霉素和异构金霉素的形式随猪的粪尿排出体外,其中金霉素原形分别占31.45和36.43%,差向金霉素占19.33和21.65%,异金霉素占8.49%和9.75%。结果表明：金霉素经动物摄食后,在体内发生了代谢和转化,有代谢产物产生；肉鸡和生长猪摄入低浓度和高浓度金霉素后,有59.27%-71.67%以金霉素及两种代谢物的形式经由排泄物排出体外,进入环境；其中金霉素原形药物占较大比例。两种动物相比,肉鸡排泄物中金霉素及其代谢物的残留总量高于猪排泄量,这可能与不同动物对金霉素的利用率和肉鸡的消化道较短有关,具体原因有待于进一步研究。4.金霉素及两种代谢物在畜禽粪便中的降解动态及影响因素探讨粪便是饲料药物进入环境的第一站,其在粪便中的存在形式和降解直接影响其在环境中的生态毒性,因此,研究畜禽粪便中的降解至关重要。本实验以”3.金霉素在动物粪便中的排泄残留动态研究”实验中不同时间段收集的猪和鸡的排泄物,重新混合,作为降解试验用样品,研究了肉鸡排泄物和猪粪尿中金霉素及两种代谢物的降解动态和半衰期；同时,为探讨粪便中药物降解的影响因素,以金霉素为研究对象,研究了不同起始浓度、灭菌处理、光照处理等环境条件对肉鸡排泄物中金霉素降解动态的影响。4.1金霉素及两种代谢物在室内模拟自然条件下的降解动态研究本实验选择上一章“排泄残留试验”中收集的高浓度组动物排泄物,充分混匀,分别测定鸡排泄物和猪粪尿混合物中金霉素、差向金霉素和异金霉素的浓度,作为降解试验的起始浓度。依照《OECD化学品测试指南》GT308--模拟降解试验方法,将粪便样品分别放置于温度为22.5℃的恒温光照培养箱内48d,光照方式采用白天光照14h晚上黑暗10h以模拟排泄物样实际接触光照状态,光照强度为4×104lx,相当于夏天正午太阳光的强度。每隔一段时间采集一次样品,测定其中金霉素及两种代谢物的浓度,绘制降解动态曲线,研究三种化合物的降解动态和半衰期。结果显示：在试验期内,肉鸡排泄物中金霉素、差向金霉素和异金霉素分别降解了53.88%、50.7%和58.9%；猪排泄物的CTC、ECTC、分别减少了56.54%和72.5%；而ICTC在处理的前7d是逐渐减少的,从4.96 mg.kg-1下降到4.05 mg.kg-1,下降了18.35%,而后一直到实验结束第48d,ICTC没有减少,反而增加了,从4.05 mg.kg-1一直上升到6.97mg.kg-1,增加了72.1%,这可能是在粪便处理期间,金霉素原形药物或其他代谢产物转化成ICTC的缘故。鸡排泄物中3种化合物和猪排泄物中CTC和ECTC的降解曲线符合一级动力学方程,相关系数均大于0.96,CTC在猪和鸡排泄物中的半衰期分别为44.15d和37.46d,ECTC的半衰期分别为51.34d和26.35d；ICTC在鸡排泄物的半衰期为33.81d。4.2金霉素降解影响因素及降解机制探讨研究为探讨动物排泄物中药物降解的影响因素,实验以肉鸡排泄物和金霉素为对象,用金霉素标准溶液制备了含不同浓度金霉素的鸡粪样品,研究了不同药物浓度、光照、灭菌处理等对金霉素降解动态的影响,以探讨粪便中金霉素的主要降解机制和影响因素。结果显示：灭菌和避光处理明显减缓了金霉素的降解速率,灭菌避光处理组金霉素的降解半衰期为138.62d,未灭菌避光组降解半衰期为63.01d,未灭菌光照组的半衰期为37.87d,这说明,鸡排泄物中的金霉素降解主要以微生物降解和光解为主,化学水解为辅；同时,粪便中金霉素的降解与金霉素的残留浓度有关。其降解动态符合一级动力学方程。降解实验结果表明：动物排泄物中的金霉素及其代谢物在自然条件下放置会被降解；但金霉素的降解受药物起始浓度、光照和微生物的影响,其中微生物降解是畜禽粪便中金霉素降解的主要方式。5.金霉素在畜禽粪便上的吸附特征研究本研究以金霉素和猪粪、鸡排泄物为研究对象,根据OECD指南106《化学品测试指南》规定的吸附/解吸试验方法--室内振荡平衡吸附试验,研究了金霉素在鸡粪和猪粪上的吸附特征、通过雨水对被粪便吸附的金霉素进行解吸,以观察雨水对畜禽粪便中金霉素迁移的影响,并对其吸附机制和影响因素进行探讨。结果表明：金霉素能被畜禽粪便强烈吸附,吸附过程属于快速吸附,在吸附5h内达到吸附平衡,吸附等温线呈非线性,能用Freundlich模型很好地描述；雨水很难解吸被粪便吸附的金霉素,存在解吸迟滞现象,用甲醇、3mol/LNaCl和3mol/LMgCl23种溶液仅分别解吸出了18.3%～20.4%、18.7%～19.4%和55.7%～57.6%被粪便吸附的金霉素。金霉素在畜禽粪便上的吸附受pH和离子强度影响,随pH值和离子强度增大吸附量减少,二价钙离子体系比一价钠离子体系对吸附的影响大。表明有机质吸附和阳离子交换可能是金霉素在畜禽粪便上主要的吸附机制,这一结果与文献报道相一致。吸附迁移实验结果表明：畜禽粪便对金霉素有很强的吸附能力,在振荡5h以内达到吸附平衡,其吸附特性符合Freundlich方程,随水相中浓度增加,吸附率升高,粪便中金霉素的吸附率在86%-93%；金霉素被粪便吸附后,用雨水都很难解析出来,这说明,金霉素被粪便吸持而在粪便中蓄积,而不易随水冲刷而迁移。6.粪源金霉素暴露对土壤微生物的生态毒性效应研究本实验通过田间小区实验研究了含金霉素残留的鸡粪施用于农田对农田土壤中微生物的毒性效应。实验选取蔬菜试验田,划分4个实验室小区2m X 2m,除对照组(不施用任何肥料)外,其他3块分别施用不含金霉素的鸡粪和2个分别含不同浓度金霉素的鸡粪,在试验期内,分别在不同时间采集土壤样品,测定土壤中微生物数量(细菌、真菌和放线菌)、土壤的呼吸强度、土壤中金霉素抗性细菌数量和微生物多样性变化等指标,结果表明：粪源金霉素的存在在一定程度上抑制了土壤中细菌、真菌和放线菌的数量,对细菌的抑制程度较大；但在实验后期,土壤中细菌等微生物的抑制程度有所减缓,这可能与随时间延长金霉素被降解减少了或土壤微生物对金霉素产生了适应有关；土壤中粪源金霉素的暴露也降低了土壤的呼吸强度,且随金霉素暴露浓度增加而抑制作用加强；同时,粪源金霉素的暴露增加了土壤中金霉素抗性细菌数量及其比率,说明,粪源金霉素暴露于土壤微生物,有诱发和增加土壤微生物中金霉素耐药菌的风险；对土壤微生物多样性的研究结果表明：粪源金霉素的暴露影响了土壤中微生物的多样性,但从DGGE电泳图谱看出,金霉素在暴露初期影响了土壤微生物的多样性,且与金霉素暴露浓度呈正相关。随金霉素暴露时间延长,土壤微生物多样性有恢复的趋势。以上通过6个试验对金霉素的检测方法、污染状况、在粪便中的排泄、吸附迁移和降解等环境行为及对土壤微生物的生态毒性进行了研究,结果表明：金霉素作为国家允许的饲料药物添加剂在饲料中长期添加使用,在国家允许的使用剂量(作为添加剂鸡20-50mg.kg-1.猪25-75mg.kg-1:治疗剂量：200mg.kg-1)范围内给肉鸡和生长猪使用后,有59.27%-71.67%以金霉素CTC和两种代谢物ECTC和ICTC的形式排入粪便,随粪便施用进入环境。进入粪便的金霉素很容易与粪便中存在的二价离子螯合,稳定的结合吸附于粪便,不容易被雨水淋洗下来,在粪便中容易蓄积而不易迁移；粪便中金霉素及两种代谢物能被微生物和光降解,降解半衰期较长,其降解速度与粪便中药物浓度及所处环境条件有关；当含金霉素粪便施用于农田土壤,改变了土壤中微生物的数量和细菌多样性,降低了土壤的呼吸强度,减弱了土壤肥力,并且增加了土壤中金霉素抗性细菌数量和比例。饲料药物添加剂金霉素在应用于动物时有较高比例的药物排入动物粪便,若动物粪便处理不当,将对环境及环境生物产生安全风险。