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肠炎沙门氏菌可以感染雏鸡并引发死亡,是造成食品安全隐患的人畜共患病菌。肠炎沙门氏菌的模式抗原LPS在LBP、CD14、MD-2蛋白分子辅助下激活TLR4-MyD88跨膜信号转导通路,诱导促炎基因的表达,介导机体炎症反应并产生抗菌作用。为阐明鸡TLR4-MyD88跨膜信号转导通路的机制以及筛选具有抗菌作用的突变位点,本研究开展以下试验:试验一:采用同源模建的方法获得鸡TLR4蛋白胞外段和MD-2蛋白的三维结构,以小鼠和人TLR4-MD-2异质二聚体空间结构为模板,对已获得蛋白三维结构进行ZDOCK对接,并分析TLR4胞外段(Asp301Glu, Arg611Gln)氨基酸突变对蛋白结构的影响。结果表明,鸡、小鼠和人TLR4-MD-2异质二聚体的互作氨基酸高度保守,互作机制存在一致性。301和611两个位点氨基酸突变引起TLR4蛋白分子内氢键数量减少和突变位点周围蛋白二级结构改变,突变后蛋白空间构象稳定性变差。试验二:从鸡脾脏cDNA中扩增875bp MyD88基因片段,克隆入pMAL-c5X表达载体,成功构建融合表达载体pMAL-MyD88,转化宿主菌BL21(DE3),用0.2mM的IPTG进行30℃诱导6h,SDS-PAGE电泳检测, MBP-MyD88融合蛋白条带在76KD附近,可溶性蛋白比例达到75%。将纯化蛋白与免疫佐剂混合免疫Balb/c小鼠,取脾脏细胞与SP2/0细胞用PEG4000融合,经过间接ELISA,3次亚克隆和Western Blot特异性检测排除针对MBP蛋白的杂交瘤,获得三株可以稳定分泌针对MyD88天然蛋白单抗的细胞株,命名为1F7、4G8和5E7,抗体亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a,轻链均为κ,抗体效价均为1:2×10~5。试验三:在分析301和611突变位点对蛋白空间结构影响的基础上,以SPF鸡为素材,对该两个位点进行DNA检测和基因分型,并选取I(903TT1832GG),II(903TG1832AA),III (903GG1832AA),IV(903TG1832AG)四种基因型于21日龄进行肠炎沙门氏菌胸肌注射,攻菌剂量为0.5mL×10~8CFU/只,攻菌后1-5DPI分别进行组织载菌量测定,并用Western Blot进行MyD88相对定量。结果显示,四种基因型在2DPI和3DPI的盲肠、脾脏和法氏囊载菌量均呈现显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)组间差异;不同基因型之间的MyD88蛋白相对表达量,在盲肠(1DPI、P<0.01,2DPI、P<0.05)、脾脏(3DPI,P<0.05)、法氏囊(2DPI,P<0.01)三个组织也呈现不同的差异。综合比较,I(903TT1832GG)基因型鸡的组织载菌量相对较低,MyD88蛋白表达量相对较高,可能对肠炎沙门氏菌的抗性较强。