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背景:肝移植是治疗终末期肝脏功能衰竭的重要方式,死亡后器官捐献是供体的主要来源。因捐献的器官热缺血损伤时间长短直接影响移植物的质量,甚至造成肝脏原发性无功使移植失败,所以了解热缺血损伤机制以及干预后减轻移植物损伤,对提高移植质量和成功率有重要意义。mi RNA是参与基因调控的一类新RNA分子,通过序列互补结合到mRNA 3,非编码区域,来降解mRNA或抑制翻译,从而调控靶基因的转录与表达。缺氧诱导因子(HIF)是细胞在基因转录水平时调节缺氧变化最重要的因子之一,其中HIF-1α与脏器热缺血关系密切,研究显示调控HIF-1α基因的表达可促进或抑制细胞凋亡。然而热缺血损伤后,miRNAs如何调控HIF-1α基因影响细胞凋亡的研究相对较少,这是本实验研究的重点内容。目的:建立小鼠肝脏热缺血模型,利用高通量测序法筛选有差异miRNAs,通过体外实验进一步对miRNA如何调控HIF-1α基因影响细胞凋亡进行探讨,以期阐明热缺血损伤后细胞凋亡的机制。方法:1.体内实验:1)通过建立小鼠肝脏热缺血损伤模型,利用高通量测序方法筛选出有明显差异miRNAs。2)从有明显差异miRNAs选取与HIF-1α相关联的某个miRNA进行研究,通过RT-qPCR检测该miRNA变化趋势。3)采用Western blot技术分析HIF-1α蛋白表达情况。4)采用HE染色检测不同时间段的肝组织病理情况。5)采用TUNEL法检测不同时间段肝组织凋亡情况。2.体外实验:1)建立小鼠肝细胞糖氧剥夺模型(模拟热缺血损伤)。2)采用RT-qPCR检测糖氧剥夺后该mi RNA表达情况。3)采用Western blot技术分析HIF-1α蛋白表达情况。4)采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。5)转染该miRNA模拟物(miRNA mimic)至细胞内,并用RT-qPCR验证转染效果。6)采用Western blot技术分析检测该miRNA过表达后HIF-1α、VEGFR2、Notch 1蛋白表达情况。7)采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:1.通过建立小鼠热缺血模型利用高通量测序方法筛选出22个有明显表达差异的miRNAs,其中10个miRNAs表达上调,12个mi RNAs表达下调。2.通过生物信息学网站查询发现,mi R-338-5p的靶基因中包含与热缺血损伤相关联HIF-1α基因,故选取miR-338-5p进行研究,发现热缺血后miR-338-5p表达上调,与高通量测序结果表达趋势一致,并且随着热缺血时间延长miR-338-5p表达逐渐增多。3.在肝脏损伤方面,随着小鼠肝脏热缺血时间的延长,肝组织HE染色显示肝细胞炎性细胞浸润明显、细胞水肿明显、窦周隙减小、肝窦淤血增多、部分肝细胞出现凋亡特征、TUNEL法检测发现随着缺血时间的延长肝组织内的细胞凋亡逐渐增多。研究还发现缺血后HIF-1α蛋白表达增多。4.细胞糖氧剥夺1 h后miR-338-5p、HIF-1α表达明显升高,细胞凋亡增多。5.通过转染miRNA-338-5p mimic至细胞,miR-338-5p过表达后HIF-1α、VEGFR2、Notch 1蛋白表达减少。6.mi R-338-5p过表达后细胞凋亡增多。结论:1.通过构建肝脏的热缺血损伤模型,建立mi RNAs表达谱,发现了热缺血损伤后miRNAs有明显变化。2.miRNA-338-5p参与肝热缺血损伤并促进了细胞凋亡。3.本研究结果提示miRNA-338-5p通过调控HIF-VEGF-Notch信号通路调控肝热缺血损伤后细胞凋亡。