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附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)是著名传统中药和川产道地药材,其原植物是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根,味辛、甘,性大热,具回阳救逆,补火救阳,逐风寒湿邪的功能,被誉为”回阳救逆第一药”。长期以来,附子生产均为高山繁种、平坝栽种,这种模式耗种量大、种源繁殖系数低,容易积累病虫害,而留种换种易造成种源混杂,最终导致产量和品质降低,严重制约附子的产业化发展。组织培养是解决种苗繁育问题的有效途径。本研究以乌头的带腋芽茎段、茎段、无菌叶片和种子为外植体,通过消毒条件、芽诱导、芽增殖、生根及移栽、愈伤组织诱导、增殖及分化等环节建立优化乌头的快速繁殖体系、种子无菌培养和再生体系,为工厂化育苗提供技术支撑。研究结果如下:1.快繁体系的建立(1)茎段快繁体系:以乌头当年生枝条的第二个腋芽为外植体,通过消毒条件、不定芽诱导、继代增殖、生根试验探索茎段快繁的最佳无菌培养条件。乌头茎段组织培养的最佳消毒条件是70%乙醇消毒50s,0.1%升汞消毒10min,污染率仅为27.78%。MS+2mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA中不定芽诱导效果最好,诱导率达86.67%。不定芽增殖条件:植物生长调节剂最佳诱导条件是MS+2 mg·L-1TDZ+0.3 mg·L-1 NAA,增殖率达100%,增殖系数达4.029;蔗糖浓度为30 g·L-1下的增殖效果最好,增殖系数达4.364;继代周期为40天,继代2次下的增殖下效果最好,增殖系数达8.1。培养基1/2MS+0.5 mg·L-1 IBA的生根效果最好,15天的生根率可达100%。(2)种子快繁体系:以乌头种子为外植体,通过消毒条件、芽诱导、芽增殖、生根和移栽试验探索种子快繁的最佳无菌培养条件。10%次氯酸钠消毒处理种子30min,消毒效果最好,外植体污染率仅为5.6%,存活率可达92.3%,因此该条件适合作为乌头种子的消毒剂,而0.1%升汞不适合作为种子的消毒剂。种子的芽诱导培养条件:植物生长调节剂诱导条件是MS+2 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA,种子萌芽率达75.1%;400 mg·L-1赤霉素浸种12h下乌头种子萌芽率最高,达97.5%。MS+0.5 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 NAA中芽增殖效果最好,增殖系数达2.23。组培苗在培养基1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA上生根培养,生根率可达88.3%,生根条数可达20。移栽基质筛选试验中,基质50%营养土+50%河沙下乌头组培苗生长效果最好,成活率达100%。(3)茎段快繁中,1节茎段外植体产生7.02株苗需要120天,而种子快繁中,1粒种子外植体产生1.92株苗需要101~120天,因此,相同时间下,茎段快繁能得到更多的苗。2.再生体系:(1)以乌头茎段和不定根为外植体,通过愈伤组织诱导、增殖和分化试验探索乌头脱分化再生途径的最佳无菌培养条件。茎段经L16(44)正交试验培养的最佳诱导条件为4 mg·L-1 2,4-D+2 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+3 mg·L-1 KT;不定根在MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA下诱导效果最好,诱导率达100%。在2.5mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA培养基中愈伤增殖效果最好,相对愈伤增殖量为2.5g。MS+2 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA培养基中愈伤分化效果最好,愈伤分化率为61.54%,平均芽数为2.25个。(2)以乌头无菌叶片为外植体,通过不定芽诱导试验探索乌头直接再生途径的最佳无菌培养条件。采用TDZ和NAA时,4 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 NAA下的不定芽诱导率最高,达92.3%,但叶片褐化严重,大部分愈伤化,且不定芽畸形,生长速度慢,因此TDZ和NAA不适用于叶片不定芽的诱导。而采用2,4-D和6-BA时,MS+2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 2,4-D中不定芽诱导效果最好,平均芽数达3.167个,毛状根率仅为12.50%。(3)茎段愈伤诱导不定芽途径中,一个茎段产生3.87个不定芽需要90天,不定根愈伤诱导不定芽途径中,一条不定根产生9.14个不定芽需要90天,而叶片直接诱导不定芽途径中,一叶片产生14.55个不定芽仅需20天。因此叶片直接诱导不定芽途径能在最短的时间内获得最多的不定芽。3.乌头快繁育苗叶片产生的不定芽增殖后生根培养,再用其不定根诱导的愈伤组织增殖分化为不定芽,最后再将不定芽增殖生根得到种苗。在最理想的状态下,一叶片经过300天的组织培养可产生91615.4株种苗。综上所述,本研究探讨了乌头带腋芽茎段快繁、种子快繁和再生体系中各培养阶段的主要影响因素,探索出利于乌头增殖、存活的最佳培养条件。通过本研究拟定的技术路线,可以显著提高乌头快繁育苗的效率及缩短育苗周期,为乌头快繁育苗的生产应用提供了技术支撑,并解决好目前市场上种苗繁育问题。