论文部分内容阅读
目的为寻找新的血吸虫病免疫诊断候选抗原分子,对基于蛋白质组技术筛选出的日本血吸虫鸟氨酸氨基转移酶(SjOAT)和亲免素(SjIP)进行体外重组表达、纯化。通过初步的实验室检测评估重组蛋白rSjOAT和rSjIP在日本血吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,体外扩增SjOAT和SjIP目的基因,以pET28a为载体转化入大肠杆菌系统中;异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,优化重组菌的诱导表达条件;大量诱导表达后,应用Ni2+亲和层析法纯化rSjOAT、rSjIP; SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性。应用重组抗原间接ELISA诊断日本血吸虫病,并与日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的间接ELISA平行检测,比较两种方法之间的敏感性、特异性和交叉反应性的差异。结果成功构建了表达型重组质粒pET28a/SjOAT和pET28a/SjIP,经IPTG诱导培养,证实构建的两种质粒均能表达。SDS-PAGE电泳分析可见相对分子质量约50KDa和55KDa处有SjOAT、SjIP融合蛋白的表达;Western blotting检测结果表明rSjOAT、rSjIP能被抗His-tag单克隆抗体、血吸虫病患者血清识别。纯化后的SjOAT蛋白浓度达0.5㎎/ ml,纯化后的SjIP蛋白浓度达1.3㎎/ ml。分别以两种重组抗原建立间接ELISA法检测急、慢性血吸虫病患者血清结果显示: rSjOAT对52份急性血吸虫患者血清、81份慢性血吸虫病患者血清的敏感性分别达到了90.4%和86.4%;检测94例正常对照者血清的假阳性率为1.1%;检测94例疫区粪检阴性者血清的阳性率为3.2%。rSjIP对上述急、慢性血吸虫病患者血清的敏感性分别达到了88.5%、79.0%;对上述正常对照者血清假阳性率为2.1%;对上述疫区粪检阴性者血清的阳性率为4.3%。将上述急、慢性血吸虫病患者血清以SEA-ELISA检测,敏感性分别为94.2%和82.7%。SEA-ELISA检测上述正常对照者血清、疫区粪检阴性者血清的阳性率为9.6%和12.8%。两种重组抗原的敏感性分别与SEA的敏感性相比较,差异无显著性(P>0.05),而特异性比较具有统计学意义(P<0.05)。rSj-ELISA和SEA-ELISA分别检测22份华支睾吸虫、36份并殖吸虫、26份钩虫感染者血清时,交叉反应性的比较显示无显著性差异。结论本研究成功克隆、表达了基于蛋白质组学技术从日本血吸虫成虫中筛选出的SjOAT和SjIP。分别建立rSj-ELISA方法,探讨了其敏感性、特异性和交叉反应性。实验结果表明这两个重组抗原用于日本血吸虫病免疫诊断时和SEA具有相似的敏感性,特异性高于SEA,可作为血吸虫感染诊断候选分子,在诊断人血吸虫病方面具有研究和应用价值。同时也证明了蛋白质组学方法筛选疾病诊断候选分子的可行性。