论文部分内容阅读
目的:肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关,也与细胞凋亡的异常有关。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosi s protein,IAP）是一类内源性细胞抑制因子,其过度表达引起凋亡不足与肿瘤发生密切相关。因此以IAP为靶点,寻找治疗恶性肿瘤的新途径,成为当今肿瘤基因治疗的研究热点。Livin是IAP家族成员之一,Vucic等因该基因在人黑色素瘤细胞中高表达,又称之为ML-IAP（melanomaIAP）,特异的分布于多种肿瘤组织,与肿瘤的发生、发展、预后及耐药相关,将可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。本实验拟构建针对人livin基因的小干扰RNA表达载体,观察对人恶性黑素瘤A375细胞凋亡和周期的影响,为探索恶性黑素瘤的基因治疗提供实验依据。方法:研究对象为人恶性黑素瘤A375细胞株。采用:（1）基因克隆技术构建pGPU6-GFP-livin-shRNA表达载体。（2）通过培养A375细胞、细胞转染,利用荧光显微镜观察pGPU6-GFP-livin-shRNA在细胞内的表达。（3）分别获取子组（空白组、脂质体组、阴性对照组、实验组1、实验组2）总RNA,采用荧光定量PCR技术检测转染前后livin mRNA的表达变化情况。（4）通过细胞转染,用流式细胞术（FCM）检测A375细胞的凋亡情况。（5）PI单染流式细胞术检测细胞周期情况。结果:（1）采用基因克隆技术成功构建pGPU6-GFP-livin-shRNA表达载体,并通过脂质体介导转染人恶性黑素瘤A375细胞株,在荧光显微镜下观察到绿色荧光。（2）荧光定量PCR结果显示:实验组1和实验组2的A375细胞在转染后48h livin mRNA表达量分别下降了17%和42%,转染后72h livin mRNA表达量分别下降了71%和61%,48h到72h干扰片段的沉默效应呈增强趋势。（3）流式细胞术结果显示:转染后48h A375细胞凋亡率:实验组1和实验组2（31.00±2.25%和34.72±1.29%）高于空白组（3.21±2.10%）（P＜0.05）,脂质体组和阴性对照组（7.67±1.34%和6.84±1.34%）与空白组相比无差异（P＞0.05）;转染后72h A375细胞凋亡率:实验组1和实验组2（34.90±1.71%和38.59±1.31%）高于空白组（3.87±3.04%）（P＜0.05）,阴性对照组和脂质体转染组（7.44±1.69%和7.89±1.44）与空白组相比无差异（P＞0.05）。（4）PI单染流式细胞术结果显示:转染后48h,shRNA-2可引起G0/G1期细胞数升高,S期细胞数下降,siRNA-1作用不明显,转然后72h shRNA-1、2均能引起引起G0/G1期细胞数升高,S期细胞数下降。结论:（1）设计出针对livin共有序列的发卡样shRNA寡核苷酸片段。（2）成功构建出针对livin的shRNA表达载体pGPU6-GFP-livin-shRNA-1、pGPU6-GFP-livin-shRNA-2。（3）shRNA-1和2均能减少A375细胞中livin mRNA的表达。（4）shRNA-1和2均能促进A375细胞凋亡。（5）shRNA-1和2均能使A375细胞周期出现G0/G1期阻滞,细胞增殖受到抑制,但调控细胞周期的作用时间点不同。