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甘蔗宿根矮化病是各个植蔗区普遍发生的病害,是甘蔗产量重要的限制因素之一,严重影响甘蔗生长,尤其是宿根蔗,造成甘蔗生产的经济损失。在高感品种上的发病率达93%,由此产生的甘蔗产量损失达27%。目前并没有有效的药剂来防治此病,最经济有效的防治措施是种植抗病品种,但至今并没有完全有效的抗病品种。此病由革兰氏阳性菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起,Lxx在体外培养需要丰富的营养、特制的培养基,是公认的难于实现体外培养的致病细菌,因此也限制了 Lxx与寄主间互作机理的研究。本研究从高感品种Badila中分离培养得到Lxx纯培养物,电子显微镜观察了 Lxx内外部形态特征,利用高通量测序技术比较了与巴西菌株LxxCTCB07的基因组差异,并观察了自然染病条件下叶片的解剖结构和叶绿体形态;利用分离培养的Lxx纯培养物接种健康脱毒甘蔗,比较染病与健康蔗株间光合作用、防御酶活性、内源激素以及基因表达上的差异,结果如下:1.用MSC培养基从高感品种中分离培养得到Lxx,经16S-23S基因间区序列上的特异性引物PCR扩增、测序比对后确认分离培养物是Lxx,并命名为LxxGXBZ01,将扩增片段上传至NCBI,登录号为KR132244。在扫描电镜下观察到Lxx菌体定殖于导管纹孔及孔壁中,许多圆形颗粒状物质粘附于导管内的纹孔及导管壁。用石蜡切片方法观察+1叶横切面,发现染病叶片的泡状细胞圆润,上窄下宽,相比于健康叶片的要大一些。用透射电镜观察叶片的叶绿体,发现染病叶片的叶绿体较小,形态从长椭圆形转变成短椭圆形;基粒片层和类囊体结构无明显变化,但嗜锇颗粒增加,淀粉粒减少,叶绿体被膜被破坏。2.收集LxxGXBZ01菌体,提取基因组DNA,通过Illumina Hiseq2000平台测序,共产出262 M数据,得到基因组大小为2446908 bp,GC含量67.94%,共有82个scaffold,2724 个 contig,scaffold 和 contig 的 N50 分别为 53480 bp、1088 bp;N90 分别为 15639 bp、405 bp。上传至NCB1,登录号为LFYU00000000。以巴西分离得到的菌株LxxCTCB07(登录号:AE16822.1)的基因组全序列作为参考序列,进行比较基因组分析,得到覆盖度为99.99%,平均深度为130。LxxGXBZ01基因组中共有13个SNP,其中同义突变3个,非同义突变2个,2个插入突变,6个缺失突变,发生在CDS的移码突变有2个。利用EzBioclound在线软件分析了 LxxGXBZO1与LxxCTCB07的ANI值,为93.61%,说明两个菌株间有较高的相似性。3.用Lxx纯培养菌液接种健康脱毒的Badila、GT11和GT29种茎,结果表明,受Lxx侵染后,品种GT11和Badila的净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳和蒸腾速率随着侵染时间的不同而呈现不同的下降趋势;品种GT29染病叶片的PEPC活性降低;而Lxx对O2·-含量、SOD和POD活性的影响,因不同的甘蔗品种和不同的接种时间而有不同的变化。染病蔗汁中的Brix与健康蔗汁无差异。4.分别在新植期和宿根期的甘蔗工艺成熟期,分析了 GT11和Badila受Lxx侵染后的新植和宿根蔗茎基部和叶片中赤霉素、脱落酸和吲哚乙酸含量的情况。结果表明,Lxx侵染后,GT11新植蔗茎中的GA3、ABA含量显著升高,宿根蔗茎中的GA3、ABA含量显著降低,而IAA显著升高;新植蔗叶片中的GA3、IAA含量显著降低,宿根蔗叶片中的GA3显著升高。Badila新植蔗茎中的ABA、IAA含量显著下降,宿根蔗茎中ABA含量显著降低、IAA含量显著升高;新植蔗叶片中GA3、IAA含量显著降低,宿根蔗叶片中GA3、ABA、IAA含量均无明显差异。这说明Lxx对甘蔗内源激素的影响因品种、部位、种植年限不同而有差异,且甘蔗对Lxx胁迫的响应涉及多种激素间的相互作用。5.用Lxx纯培养菌液接种健康脱毒的Badila种茎,分别于接种60 d、90 d后,砍取茎基部,提取RNA并构建RNA-seq测序文库,随后在IlliminaHiseq平台上进行测序,结果共得到299199个转录本和156713个Unigene,转录本和Unigene的N50分别为1875 bp和1348 bp,N90分别为442 bp和279 bp。健康与染病蔗株间在处理60 d后共有37个差异表达基因,染病蔗株上调基因9个,下调基因28个;处理90 d后共有371个差异表达基因,染病蔗株上调基因267个,下调基因104个。这些差异基因中与植物抗逆响应关系密切的Pathway有苯丙烷代谢,萜类化合物生物合成,植物信号转导,谷胱甘肽代谢,ABC转运蛋白,苯丙氨酸、色氨酸、络氨酸生物合成,半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等等,说明甘蔗通过多条代谢途径在响应Lxx的胁迫,是一个综合复杂的响应过程。