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兔出血症病毒(Rabbit Haemorrhagic Disease Virus,RHDV)隶属于嵌杯病毒科兔病毒属,是成年兔急性、烈性、高度接触性传染病,即兔病毒性出血症(Rabbit Haemorrhagic Disease,RHD)的病原体。2010年在法国的家兔和野兔中发现了一种新型的RHDV突变体,并命名为RHDV2。研究表明,RHDV1(传统的RHDV)和RHDV2有着不同的抗原性和遗传特性,系统进化树分析RHDV2为一个独立的分支,可能为兔病毒属的一个新的成员。在我国还没有对RHDV2的报道,加强对RHDV的病原学、流行病学、诊断方法和预防措施的综合性研究显得十分必要和紧迫。VP60蛋白是RHDV的主要衣壳蛋白,在机体诱导抗病毒感染的免疫反应中起着重要的作用,是RHDV的免疫保护性抗原。本实验首先设计引物扩增RHDV1 TP株(登录号:AF453761.1)的VP60序列,并克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达载体p ET-R1-VP60。合成Gen Bank中已发表RHDV2 10-32株(登录号:HE800532.1)的VP60序列并将其克隆至原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达载体p ET-R2-VP60。阳性质粒分别转化E.coli BL21 Star(DE3)p Lys S表达菌,经IPTG诱导后两种亚型的VP60重组蛋白p VP60-1和p VP60-2均得到大量表达。KCl染色后切胶纯化VP60重组蛋白,Western blot检测表达的p VP60-1和p VP60-2均具有良好的抗原性。将纯化的p VP60-1和p VP60-2分别与佐剂混合作为免疫原分别免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤融合技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。通过比对RHDV1和RHDV2的氨基酸序列,合成了6段差异性多肽。以p VP60-1和p VP60-2、合成的差异肽以及RHDV1 TP株作为检测抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌抗RHDV1及抗RHDV2单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞。通过有限稀释法进行3次亚克隆,共筛选到20株稳定分泌抗RHDV1的单抗株,其中有3株仅能识别RHDV1,分别命名为1D6、1H2、3F2;筛选到15株稳定分泌抗RHDV2的单抗株,其中有4株仅能识别RHDV2,分别命名为1G2、2C1、3B7、5D6。为了进一步鉴定这7株MAb的差异识别性,应用真核表达的VP60重组蛋白对7株MAb进行间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析。首先采用体内诱生腹水法制备7株MAb的单克隆抗体。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,将表达RHDV1 vp60基因的重组杆状病毒(Bac-R-VP60)和表达RHDV2 vp60基因的重组杆状病毒(Bac-R2-VP60)接种Sf9细胞,分别表达了s VP60-1蛋白和s VP60-2蛋白,对7株MAb进行IFA鉴定。以真核表达载体pc DNA3.1(+)为骨架构建pc DNA-R1-VP60和pc DNA-R2-VP60重组质粒,转染hela细胞分别表达了RHDV1型VP60蛋白e VP60-1蛋白和RHDV2型e VP60-2蛋白,对7株MAb进行Western blot和IFA鉴定。IFA和Western blot结果表明1D6、1H2和3F2单独识别RHDV1 VP60蛋白,其中1D6的抗原表位为256RWNGQ260,1H2和3F2的抗原表位相同均为312VLQFW316;1G2、2C1、3B7和5D6单独识别RHDV2 VP60蛋白,其中2C1的抗原表位为324ADNPIS329,1G2、3B7和5D6的抗原表位相同均为294AIDHD298(倾斜字体为不同亚型中表达差异的氨基酸)。将鉴定的抗原表位与NCBI发布的兔病毒属成员VP60蛋白的氨基酸序列比对分析的结果表明只针对RHDV1 VP60蛋白单抗的抗原表位同源性为98%,而只针对RHDV2 VP60蛋白单抗的抗原表位同源性为100%。以上结果表明筛选得到的差异识别单抗的差异识别性比较稳定,能够区分不同亚型的RHDV,为型特异性单抗。本研究通过杂交瘤融合技术制备了RHDV病毒型特异性单克隆抗体,并鉴定出了特异性单抗的抗原表位。型特异性单抗株的制备为RHDV的鉴别诊断建立奠定了基础,对RHDV的流行病学调查,遗传进化分析及防控具有重要的意义。